一种耐盐酯酶及其编码基因和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程和酶工程领域，具体设及一种耐盐醋酶及其编码基因和应 用。
【背景技术】
[0002] 醋酶巧sterases，EC3. 1. 1.讶是一种催化醋键水解和合成的酶的总称，水解时 催化醋键产生甘油和脂肪酸；合成时，把酸的簇基与醇的径基脱水缩合，产物为醋类及其他 香味物质。醋酶是一类用途广泛的水解酶，在食品加工及食品风味改良、油脂水解、皮革絹 纺原料脱脂、废水处理、洗涂工业和医药行业等领域得到广泛的使用。近几年，醋酶的新功 能和新用途不断被发现和拓展，从而使醋酶具有更高的研究价值和更广阔的应用前景。醋 酶广泛存在于动物、植物和微生物中。动物膜脏醋酶和微生物醋酶是醋酶的主要来源。
[0003] 宏基因组学（Metagenomics)是近年来随着微生物学和现代生命科学的迅猛发展 兴起的一口新兴的科学技术。其基本研究思路是直接提取环境中所有微生物的基因组DNA， 克隆到合适的载体，构建宏基因组文库，将环境中全部微生物的核酸信息收集在一起，并运 用序列筛选或功能筛选方式从文库中获得有用的酶、抗生素、活性物质等。运种完全不依赖 于环境中微生物的分离和培养的技术拓展了微生物学的研究思路与方法，为从不同自然生 境中的未培养微生物中寻找新的基因资源和活性物质提供了有力的技术手段。
[0004] 目前，已有报道细菌醋酶及其基因专利筛选于宏基因组文库。中国专利 200810226942. 6提供了一种醋酶新基因Estpi及其重组表达体系，该基因克隆自中国 南海海底100m深海底泥宏基因组文库。中国专利200810222671. 7提供了一种醋酶及其 编码基因与应用，该基因克隆自中国南海778. 5m深海沉积物宏基因组文库。中国专利 201010521640. 9提供了一种醋酶及其编码基因与应用，该基因克隆自沼气池宏基因组文 库。中国专利201110208211. 0提供了一种低溫醋酶及其编码基因与应用，该基因Est6克 隆自太平洋深海5886m深海沉积物宏基因组文库。然而，未见有醋酶基因克隆自我国传统 调味品环境宏基因组文库。
【发明内容】
阳0化]本发明所解决的技术问题在于提供一种醋酶基因，该基因克隆自我国传统调味品 环境宏基因组文库。
[0006] 本发明所解决的技术问题在于提供一种醋酶基因，该基因编码的醋酶具有很强的 耐盐性，在10~18%化C1条件下，酶蛋白可保持良好的催化活性。
[0007] 本发明所解决的技术问题在于提供一种醋酶，该酶能够可催化乙酸、丙酸、戊酸、 己酸与乙醇、丙醇、下醇、戊醇、己醇合成乙酸乙醋、丙酸丙醋、戊酸下醋等相应的短链芳香 醋化合物，对丰富醋酶家族成员，开发新的短链芳香醋化合物合成途径都具有重要意义。 [000引本发明所解决的技术问题在于提供一种合成短链芳香醋化合物的方法，利用基因 工程获取的重组醋酶合成短链芳香醋化合物。
[0009] 为了解决上述技术问题，一方面，本发明提供了一种醋酶蛋白质分子，该蛋白质分 子具有如SEQIDN0:2所示的氨基酸序列。
[0010] 另一方面，本发明提供了一种醋酶基因，该醋酶基因具有编码权利要求1中蛋白 质分子的核巧酸序列。
[0011] 其中，在本发明的一个实施例中，该醋酶基因具有如SEQIDNO: 1所示的核巧酸序 列。
[0012] 对于具有如SEQIDNO: 1所示的核巧酸序列的醋酶基因，该序列无内含子，具有 948bp完整的开放读码框，编码316个氨基酸的多肤。
[0013] 另外，本发明还提供了一种获取醋酶基因的方法，包括如下步骤：
[0014] 步骤一、提取我国传统发酵食品环境样品，提取起总DNA并纯化；
[0015] 步骤二、将纯化后的总基因组经Sau3AI酶切处理；
[0016] 步骤Ξ、将酶切产物连接到pUC18/BamHI0AP)载体上，电击转化大肠杆菌D册α 中构建我国传统发酵食品环境宏基因组文库，用含有^氨节青霉素、Ξ憐酸甘油醋、葡萄 糖和氨基酸复合物的培养基作为选择培养基，从文库中筛选醋酶阳性克隆，通过高通量筛 选得到阳性克隆子；
[0017] 步骤四、经测序和Blast比较设计引物，W阳性克隆子的质粒为模板，用设计好的 引物进行链式酶聚合反应，从而克隆得到如SEQIDNO: 1所示的目的片段。
[0018] 其中，步骤四中设计用于扩展目的片段的引物包括：
[0019] 上游引物F1 :5, -CGCGGATCCATGGTCCCCGCCGCCGAGTC-3,；
[0020] 下游引物F2 :5 ' -CGGAAGCTTGGCCTGGCTGTGACATCC-3，。
[0021] 另外，本发明还提供了一种重组醋酶的制备方法，包括如下步骤：
[00巧 （1)采用如权利要求5中所述方法获取醋酶基因，该基因具有如SEQIDN0:1所示 的核巧酸序列；
[0023] (2)用上述基因目的片段经过化ndlll和BamHI双酶切，与表达载体祀T-32a(+) 连接；
[0024] 做用表达载体祀T-32a(+)转化宿主细胞化21触3)，培养转化体，经IPTG诱导， 从培养物分离、纯化，获得重组醋酶。该重组醋酶具有W酸类和醇类单体为原料合成短链芳 香醋化合物的作用。
[00巧]另外，本发明还提供了一种利用重组醋酶合成短链芳香醋化合物的方法，其特征 在于包括如下步骤：
[0026] (1)采用如权利要求5中方法制备重组醋酶；
[0027] (2)将上述重组醋酶粗酶液或纯化的酶液加入到合成反应体系中，在25-35Γ条 件下进行酶催化反应l-6h，合成相应的短链芳香醋化合物。
[0028] (3)上述合成反应体系是W有机溶剂正戊烧、正己烧、正庚烧、正辛烧为介质。
[0029] (4)上述合成反应体系是W乙酸、丙酸、下酸、戊酸或己酸，与乙醇、丙醇、下醇、戊 醇或己醇为底物，所述底物的物质的量之比为1 : 2,底物酸的浓度为100~200mM。
[0030] 相比于现有技术，本发明的技术方案应用宏基因组技术从我国传统调味品环境宏 基因组文库获得的醋酶，发现了该酶具有耐盐性，在10~18%化C1条件下，酶蛋白可保持 良好的催化活性，具有良好的应用潜力，并且对丰富醋酶家族成员，开发我国传统调味品环 境资源都具有重要意义。另外，本发明的方案还通过对该酶在合成短链芳香醋化合物反应 中的最适条件进行研究，发现了在W乙酸、丙酸、下酸、戊酸或己酸，与乙醇、丙醇、下醇、戊 醇或己醇为底物原料的短链芳香醋化合物合成反应中，本发明的醋酶在25-35Γ条件下进 行酶催化反应1-化，所述底物的物质的量之比为1 : 2,底物酸的浓度为100~200mM，采用 上述反应条件能够高效、快速地合成目的产物，醋化率可W达到80 %~90%，具有很好的 应用价值。
[0031] 下面结合附图和【具体实施方式】进一步详细描述本发明，但本发明不局限于运些实 施方式，任何在本发明基本精神上的改进或替代，仍属于本发明权利要求书中所要求保护 的范围。
【附图说明】
[0032] 图1重组醋酶纯化的SDS-PAGE电泳图。M:ProteinMarker;1:纯化后蛋白。
[0033] 图2纯化的醋酶的底物特异性测定结果。
[0034] 图3纯化的醋酶的耐盐性测定结果。
[0035] 图4纯化的醋酶的最适反应溫度测定结果。
[0036] 图5纯化的醋酶的最适反应抑值测定结果。
【具体实施方式】
[0037]为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。
[003引实施例1醋酶基因的获得及合成短链芳香醋化合物功能的验证
[0039] 1、醋酶基因的获得
[0040] 从我国传统发酵食品（酱油、腐乳、豆酱等）环境样品，构建发酵食品环境宏基因 组文库。用含有100μg/ml氨节青霉素、1%Ξ憐酸甘油醋、1 %葡萄糖和0.5%氨基酸复合 物的培养基作为选择培养基，从文库中筛选醋酶阳性克隆。将文库中的细胞同影印接种针 复制到固体选择性培养基平板上，37Γ下培养3天，筛选菌落周围有水解圈出现的阳性克 隆子。
[0041] 提取上述阳性克隆子的质粒送去测序公司进行测序，得到一个醋酶的核酸序列， 该序列由948个碱基组成，其核酸序列如SEQIDNO. 1所示，将其命名为est_115 ;该核酸 编码的多肤，含316个氨基酸，其氨基酸序列如SEQIDNO. 2所示，将其命名为EST_115。
[0042] 2、基因片段的克隆
[0043] 根据核酸est_115序列，设计扩增引物：上游引物F1 :5'-CGCGGATCCATGGTCCCCGCC GCCGAGTC-3'（下划线为BamHI酶切位点序列）；下游引物F2 :5'-CGGAAGCTTGGCCTGGCTGTGA CATCC-3'（下划线为Hindlll酶切位点序列）。 W44]W阳性克隆子的质粒为模版