一种热稳定性和催化效率提高的普鲁兰酶突变体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种热稳定性和催化效率提高的普鲁兰酶突变体，属于酶工程技术领 域。
【背景技术】
[0002] 普鲁兰酶是解支酶的一种，能水解的最小底物只需两条由α-1，6糖巧键连接的 含有两个由α-1,4糖巧键连接的葡萄糖链段。由于淀粉结构的复杂性，在淀粉解聚为低 聚糖或小分子单糖的过程中必须由多种酶协同作用。在淀粉糖化过程中，由于糖化酶对 α-1，6糖巧键的作用有限，因此目前双酶法生产淀粉糖制品的最高转化率只能达到96%。 如果在糖化过程中添加普鲁兰酶与糖化酶协同作用，则可将转化率提高到97%W上，并提 高生产效率，降低生产成本。
[0003] 对普鲁兰酶的首次报道是在1943年，而普鲁兰酶的研究热潮始于1966年，Bender 和Wallenfels首次通过产气杆菌Klebsiellaaerogenes发酵获得普鲁兰酶。到目前为止， 已经从芽抱杆菌、产气气杆菌、放线菌，链球菌、链霉及一些嗜热菌中发现普鲁兰酶，不同来 源的普鲁兰酶，酶学性质也各有不同。由于糖化酶的作用条件具有高溫（55°C-65°C)和 弱酸性（pH4. 5-5. 5)的特点，所W大多数天然的普鲁兰酶的酶学性质限制了其在工业生 产中的应用。
[0004]I型普鲁兰酶是糖巧水解酶13家族的成员之一，该家族成员的主要的催化部位 由四个结构域A、B、C、F构成。结构域A是由8个β-折叠、8个α-螺旋构成的中央催化 的（β/α)8折叠桶结构，该区域包含了催化Ξ联体（Asp,Asp,Glu)。较小的结构域Β插入 (0/α)8折叠桶的第Ξ个β-折叠和第Ξ个α-螺旋的中间，活性口袋正位于该结构域， 且（β/α)8折叠桶桶壁也由该结构域构成。由8个β-折叠形成希腊钥匙拓扑结构是结 构域C的特征性结构。而F结构域由一个小的a螺旋和6个β-折叠，折叠形成的βΞ明 治基序的β-反平行片层。结构域A的C端和Ν端分别连接着结构域C和结构域F。 W05]GH13家族的酶蛋白的氨基酸序列中几乎都含有四段高度保守的序列 巧egionl-IV)。所有I型普鲁兰酶几乎都含有一段保守序列ReginA灯NWGYD巧。运段序列 位于酶的中部，只与底物中的α-1,6糖巧键相结合。
[0006]对来源于Κ.aerogenes的I型普鲁兰酶中的HiS-607、Asp-677、HiS-682 和 His-833进行突变后，His-607、Asp-677和His-833氨基酸改变后的酶蛋白活性完全丧失， 而化S-682的替换并不影响酶活性，对运些突变株进行α-或β-环糊精的结合亲和力分 析，发现化S-607,Asp-677的改变对普鲁兰酶与底物普鲁兰多糖的结合力产生负面影响， 但是化S-833的改变并没有对普鲁兰酶与底物的结合产生影响，表明化S-607,Asp-677是 与普鲁兰酶结合底物相关的位点，而His-833影响着普鲁兰酶的催化功能。
【发明内容】
[0007] 为了克服上述问题，本发明利用定点突变获得耐热性和催化效率提高的普鲁兰酶 突变体。本发明采用全质粒PCR的方法对581位苯丙氨酸进行定点饱和突变，获得了热稳 定性和催化活性同时提高的突变酶F581L和巧81V，解决了普鲁兰酶的热稳定性不能满足 糖化反应条件的问题，为拓宽普鲁兰酶的工业应用奠定了基础。
[0008] 本发明的目的是提供一种普鲁兰酶突变体，所述突变体的氨基酸序列是
[0009] (1)沈QIDNO: 1或沈QIDNO: 2所示的序列；
[0010] 似在严格条件下与（1)限定的氨基酸序列杂交且编码具有普鲁兰酶活性的氨基 酸序列。
[0011] 在本发明的一种实施方式中，所述突变体是对K.variicola来源的普鲁兰酶进行 氨基酸突变得到的。
[0012] 在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将K.variicolaSHN-1来源的普鲁兰 酶（NCBI上GenBankaccessionno.JX087429)的第581位氨基酸突变成疏水性氨基酸。
[0013] 在本发明的一种实施方式中，所述突变，是突变成鄉氨酸或亮氨酸。
[0014] 在本发明的一种实施方式中，所述突变体的核巧酸序列是SEQIDNO:3或SEQID NO:4所示的序列。
[0015] 本发明还要求保护编码所述突变体的核巧酸片段、含有编码权利要求1所述突 变体的基因的载体、表达所述突变体的基因工程菌（尤其是大肠杆菌、酵母或枯草芽抱杆 菌），W及所述突变体在食品、化工或纺织领域的应用。
[0016] 突变体命名方式：
[0017] 采用"原始氨基酸位置替换的氨基酸"来表示突变体。如S234F，表示位置234的 氨基酸由亲本普鲁兰酶的Ser替换成化e，位置的编号对应于亲本普鲁兰酶的氨基酸序列。
[0018] 本发明的有益效果：
[0019] 本发明通过K.variicolaSHN-1普鲁兰酶化vPul)的地e581进行定点饱和突变， 获得热稳定性和催化活性同时提高的突变酶巧81L和巧81V。F581L和巧81V的最适溫度 由53°C提高到56°C，在55°C下的半衰期分别比野生型提高了 4. 20min、3.Olmin。同时，与野 生型相比，F581L和巧81V的VmJ直分别提高至2. 78倍、2. 85倍，k。。,/枯值提高至1. 6倍， 表明本发明的突变体拥有更高的催化效率。同时，本发明的突变体的最适抑没有变化，具 有更高热稳定性、更高催化效率、未改变最适抑的普鲁兰酶更适合糖化中应用。
[0020] 普鲁兰酶测定方法： 阳02U 取100μL用lOOmM、pH5. 0的醋酸缓冲适当稀释的酶液与等体积的溶于lOOmM、 pH5.0醋酸缓冲中的lOg/L普鲁兰多糖相混合于50°C水浴中保溫30分钟。加入DNS试剂 300μL摇匀，置于沸水中煮沸15分钟，取出W流动水迅速冷却后，于540nm波长处，测定反 应液的吸光度值。
[0022] 酶活单位定义：在上述指定的条件下，每分钟催化分解普鲁兰多糖生成相当于 1μmol葡萄糖的还原糖所需的酶为1个酶活单位扣)。
【具体实施方式】
[0023] 实施例1:突变质粒构建
[0024] 利用质粒提取试剂盒PlasmidMiniKit(购于OMEGABI0-T邸公司）从实验 室保藏的E.coliBL21(DE3)/pET-28a-kvpul(Wen-BoQien,Yao化e,YanXu.Si即al Peptide-Independent Secretory Expression曰nd Ch曰r曰cteriz曰tion of Pullul曰n曰se from a Newly Isolated Klebsiella variicola SHN-1 in Escherichia coli.Appl Biochem Biotechnol (2013) 169:41-54.)中提取质粒作为饱和定点突变的模板，所用的简 并引物序列为5' -3' GGC TAC GAT CCG NNK CAC TACACG GTG CC(序列如SEQ ID N0:5所 示）。 阳0巧]利用PrinKSTAR"服PCR酶（购于TaKaRa公司）采用全质粒PCR的方法对地e581 进行定点饱和突变。PCR反应体系为：10μ1SXPrimestarbuffe;r，4iildNTPmixture, 0.