一种质粒dna的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于DNA的制备方法技术领域，尤其涉及一种质粒DNA的制备方法。
【背景技术】
[0002]高质量的DNA对于进行高效的转染至关重要，以前研究者使用CsCl梯度离心得到的DNA进行转染，但是这种方法既需要昂贵的超速离心机，又费时费力，目前很少有人使用。目前超纯质粒的提取大多应用基于柱层析技术建立的纯化试剂盒，这以德国QIAGEN公司的产品最为著名。QIAGEN公司利用基于专利的阴离子交换层析技术，在70分钟内，每次可得到20 μ g-10mg相当于2次CsCl超离心纯度的质粒DNA，但这种试剂盒的价格对大多数国内实验室来说是难以承受的。Saporito-1rwin SM等人m建立了手工提取质粒的方法，声称该方法快捷(耗时三小时内)、成本低廉，纯化的质粒达到了用QIAGEN柱纯化的质粒的相同质量。但在实际应用中，发现Saporito-1rwin SM方法提取质粒的转染效率远低于QIAGEN柱纯化质粒的转染效率，以致于影响后续实验的进行。所以我们在Saporito-1rwinSM方法的基础上作了进一步改进，提出了耗时较短，操作简便，安全无污染的高纯度质粒提取方法，所提质粒纯度确实达到与用QIAGEN公司试剂盒所提的质粒纯度相篦美的程度。该方法虽然没有QIAGEN试剂盒快捷，但由于国内人力资源丰富而廉价，所以还是值得推广。
【发明内容】
[0003]本发明就是针对上述问题，提供一种纯度高的质粒DNA的制备方法。
[0004]为实现上述目的，本发明包括以下步骤。
[0005]1)挑取含有质粒的单菌落接种到具有相应抗性的LB培养基中，振荡培养过夜.取过夜培养的菌液，接种到具有相应抗性的LB培养基中，振荡培养。
[0006]2)转移菌液至离心瓶中，离心，去上清。
[0007]3)将细菌沉淀重悬溶液I中，剧烈振荡，使菌体分散混匀。
[0008]4)加溶液II，将离心瓶温和颠倒数次混匀，并将离心瓶放置于冰上，使细菌裂解。
[0009]5)加入预冷的溶液III，将离心瓶温和颠倒数次混匀，在冰上放置。离心lOmin。
[0010]6)将上清倾到进离心管中，加入异丙醇混匀，离心，去尽上清。
[0011]7)将沉淀溶于1TE，然后将溶液转移到离心管，加入NH4Ac，颠倒数次混匀，在冰上放置，离心。
[0012]8)将上清均分进二个离心管，然后各加入异丙醇混匀，放置，离心，去尽上清。
[0013]9) 二个离心管各加入1TE溶解沉淀，然后将溶液合并到一个离心管中，水浴以降解RNA分子。
[0014]10)加入的PEG8000+1.6mol/L NaCl,颠倒数次混匀，在冰上放置，然后离心，
去尽上清。
[0015]11)将沉淀完全溶于ΤΕ，加入NH4Ac混匀，然后加入异丙醇，颠倒数次混匀，在冰上放置，离心，去尽上清。
[0016]12)加入乙醇洗涤沉淀和离心管内壁，吸去乙醇，进行短暂的离心，然后尽量吸走剩余的乙醇.将离心管开盖室温放置，使沉淀表面的乙醇挥发.最后视沉淀多少加入TE溶解沉淀。
[0017]作为一种优选方案，本发明所述步骤1)挑取含有质粒的单菌落接种到3ml具有相应抗性的LB培养基中，37°C振荡培养过夜.取2ml过夜培养的菌液，接种到200ml具有相应抗性的LB培养基中，37°C振荡培养11一 14小时。
[0018]2)转移菌液至250ml离心瓶中，在4°C下4000rpm离心lOmin,去上清。
[0019]3)将细菌沉淀重悬6ml溶液I中，剧烈振荡，使菌体分散混匀。
[0020]4)加6ml溶液II，将离心瓶温和颠倒数次混匀，并将离心瓶放置于冰上5min，使细菌裂解。
[0021]5)加入5ml预冷的溶液III，将离心瓶温和颠倒数次混匀，在冰上放置lOmin。在4°C下 10，000g 离心 lOmin。
[0022]6)将上清倾到进50ml离心管中，加入12ml异丙醇混匀，_20°C放置lOmin，在4°C下10，000g离心lOmin,去尽上清。
[0023]作为另一种优选方案，本发明所述步骤7)将沉淀溶于850 μ 1ΤΕ，然后将溶液转移到1.5m离心管，加入400 μ 1 10mol/L NH4Ac,颠倒数次混匀，在冰上放置lOmin,在4°C下 lO’OOOg 离心 lOmin。
[0024]8)将上清均分进二个1.5m离心管，然后各加入600 μ 1异丙醇混匀，_20°C放置lOmin,在4°C下12，000g离心lOmin,去尽上清。
[0025]9) 二个1.5m离心管各加入100 μ 1ΤΕ溶解沉淀，然后将溶液合并到一个1.5m离心管中，37 °C水浴20min以降解RNA分子。
[0026]10)加入200 μ 1的15%PEG8000+1.6mol/L NaCl,颠倒数次混匀，在冰上放置20min,然后在4°C下14,000g离心15min,去尽上清。
[0027]11)将沉淀完全溶于200 μ 1 ΤΕ，加入80 μ 1 10mol/L NH4Ac混匀，然后加入280 μ 1异丙醇，颠倒数次混匀，在冰上放置lOmin,在4°C下12，000g离心lOmin，去尽上清。
[0028]12)加入700 μ 1 70%乙醇洗涤沉淀和离心管内壁，吸去70%乙醇，进行短暂的离心，然后尽量吸走剩余的乙醇.将离心管开盖室温放置lOmin，使沉淀表面的乙醇挥发.最后视沉淀多少加入300-700 μ 1 ΤΕ溶解沉淀。
[0029]本发明有益效果。
[0030]本发明提取的质粒质量与QIAGEN plasmid midi Kit提取的质粒质量相比较，在理化指标上没有差别，关键是对于哺乳动物胞转染具有同样的效率.所以本方法提取的质粒的纯度应达到QIAGEN试剂盒所宣称超纯状态(相当于2倍Cscl超离心的质粒纯度)，随质粒不同，我们制备的质粒产率也不同，一般是2-5 μ g质粒/ml菌液.本方法所使用试剂十分廉价，导致提取得到质粒成本非常低廉，虽然整个实验耗时3—4个小时，由于国内人力资源丰富而廉价，采用本方法制备用于哺乳动物细胞转染的超纯质粒，在经济上十分划算。
【具体实施方式】
[0031]本发明包括以下步骤。
[0032]1)挑取含有质粒的单菌落接种到具有相应抗性的LB培养基中，振荡培养过夜.取过夜培养的菌液，接种到具有相应抗性的LB培养基中，振荡培养。
[0033]2)转移菌液至离心瓶中，离心，去上清。
[0034]3)将细菌沉淀重悬溶液I中，剧烈振荡，使菌体分散混匀。
[0035]4)加溶液II，将离心瓶温和颠倒数次混匀，并将离心瓶放置于冰上，使细菌裂解。
[0036]5)加入预冷的溶液III，将离心瓶温和颠倒数次混匀，在冰上放置。离心lOmin。
[0037]6)将上清倾到进离心管中，加入异丙醇混匀，离心，去尽上清。
[0038]7)将沉淀溶于1TE，然后将溶液转移到离心管，加入NH4Ac，颠倒数次混匀，在冰上放置，离心。
[0039]8)将上清均分进二个离心管，然后各加入异丙醇混匀，放置，离心，去尽上清。
[0040]9) 二个离心管各加入1TE溶解沉淀，然后将溶液合并到一个离心管中，水浴以降解RNA分子。
[0041]10)加入的PEG8000+1.6mol/L NaCl,颠倒数次混匀，在冰上放置，然后离心，
去尽上清。
[0042]11)将沉淀完全溶于ΤΕ，加入NH4Ac混匀，然后加入异丙醇，颠倒数次混匀，在冰上放置，离心，去尽上清。
[0043]12)加入乙醇洗涤沉淀和离心管内壁，吸去乙醇，进行短暂的离心，然后尽量吸走剩余的乙醇.将离心管开盖室温放置，使沉淀表面的乙醇挥发.最后视沉淀多少加入ΤΕ溶解沉淀。
[0044]所述步骤1)挑取含有质粒的单菌落接种到3ml具有相应抗性的LB培养基中，37°C振荡培养过夜.取2ml过夜培养的菌液，接种到200ml具有相应抗性的LB培养基中，37°C振荡培养11 一 14小时。
[0045]2)转移菌液至250ml离心瓶中，在4°C下4000rpm离心lOmin,去上清。
[0046]3)将细菌沉淀重悬6ml溶液I中，剧烈振荡，使菌体分散混匀。
[0047]4)加6m