一种转基因植株dna的提取方法

文档序号:9611717
一种转基因植株dna的提取方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物化学技术领域,具体的说是设及一种转基因植株DNA的提取方 法。
【背景技术】
[0002] 目前,拟南芥和烟草是最常用模式植物,在基因功能研究中起到举足轻重的作用。 在转基因工作中,经常需要提取转基因植株的DNA,比如转基因鉴定、插入位点检测、拷贝数 分析等。由于每个转基因株系的插入位点和拷贝数存在差异,通常需要提取几十株甚至几 百株植株的DNA,工作量巨大。因此如何一次性获得质量好且量足够的转基因植株DNA,是 转基因研究工作开展的前提。 阳00引常规拟南芥和烟草提取DNA的方法由W下两种:SDS法和CTAB法。
[0004]SDS法,步骤如下:(1)取新鲜的拟南芥叶片2-3片加入2血的离屯、管中,加入 液氮,玻璃棒研碎;(2)研磨W后,加入600-700μL的提取液,混匀,然后在60°C下水浴 20-60min;(3)4°C下12OOOr/min离屯、lOmin;(4)取上清液至一新管,加入等体积的氯仿: 异戊醇(24 :1),4°C下12 00化/min离屯、7min; (5)取上清液至一新管,加入70%体积的异 丙醇,混匀,4°(:下1200化/111111离屯、15111111;(6)弃上清,70%乙醇洗2次沉淀,吹干;(7)溶 于 20-30μL含有 0.Img/mLRNase的(1地2〇 中。 阳0化]CTAB法,步骤如下:(1)取一片大小为0. 5cmX2cm的新鲜叶子用液氮快速冷冻后 放置于1. 5mL的巧pendorf管中用末端烧溶合蓝枪头娠碎;(2)研磨W后,加入600μL的提 取液,颠倒离屯、管数次混匀,然后在65°C下水浴60min;做取出后加等体积的酪:氯仿:异 戊醇(25:24:1)抽提液,混匀,用E:ppendo;rf离屯、机于 4°C,10000;r/min离屯、5min。(4)将 上清液转至新的离屯、管中,加入RNaseA至终浓度为1μg/mL,在37°C下放置30min。再加 入等体积的酪:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提液抽提一次,同样用化pendorf离屯、机于4°C, 1000化/min离屯、5min; (5)将上清液转至新的离屯、管中,用等体积的氯仿/异戊醇抽提一 次。将水相转至新的离屯、管中,加入1/10体积3mol/L的NaAc(抑5. 2),3倍体积的100% 乙醇后-70°(:放置8~12111111,沉淀0臟;(6)4°(:,10000以111111离屯、10111111。弃去上清液,用 70%乙醇洗涂DNA沉淀两次;(7)放置于室溫惊干后,加入20μLTE缓冲液溶解DNA后保 存于-20°C用于PCR实验。
[0006] 上述两种DNA的提取方法主要存在的缺陷或不足之处为:
[0007] (1)现行方法存在使用大量有毒试剂的问题,比如β-琉基乙醇、异戊醇和饱和 酪,运些试剂均有毒且发出难闻的气味,对实验操作者带来风险,并且容易污染环境。
[0008] (2)直接在1. 5血或2血的巧pendorf管中利用枪头对样品进行研磨,通常研磨不 充分,容易导致DNA提取失败,并且不适合大规模转基因样品DNA的提取。
[0009] (3)DNA提取率低,难W满足多项实验检测的需要。
[0010] 公开于该【背景技术】部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解,而不应 当被视为承认或W任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

【发明内容】

[0011] 针对现有拟南芥和烟草提取DM的方法的不足,本发明的目的是提供一种适合于 大规模转基因拟南芥和烟草DNA的提取方法。 阳012]本发明提供的技术方案为:
[0013] 一种转基因植株DNA的提取方法,包括W下步骤:
[0014] (1)先将2%CTAB提取液置于65°C水浴锅中预热,在使用前摇匀;
[0015] (2)取转基因烟草或拟南芥叶片l-2g置于研鉢中,向研鉢中加入预热后的CTAB提 取液2. 4mU再加入l-2g石英砂,将其研磨成匀浆液,得到匀浆液;
[0016] 做吸取1. 0血匀浆液加入到2血离屯、管中,置于65°C水浴比,每20min轻摇1 次;
[0017] (4)待水浴结束后取出离屯、管,向每管匀浆液中加入0. 6mL氯仿,混匀,然后将离 屯、管在常溫、转速为lOOOOr/min下离屯、8min;
[0018] (5)吸取离屯、管中的上清液0. 7血加入到另一个新的2血离屯、管中,再加入0. 5血 的异丙醇,混匀,于-20°C沉淀20min,在常溫、转速为1000化/min下离屯、8min;
[0019] (6)去除上清,用ImL70%的酒精洗涂沉淀1次,移除酒精,然后在常溫、转速为 100(K)r/min下离屯、Imin,再用移液枪吸取离屯、管中剩余的酒精,在室溫下放置5-lOmin;
[0020] (7)往离屯、管中加入200μL的TE缓冲液溶解沉淀,摇匀,使之溶解完全,所得溶液 即为转基因烟草或拟南芥DNA提取液,将其置于-20°C下保存,备用。 阳021] 与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
[0022] (1)本方案提取液中不用有毒难闻的试剂β-琉基乙醇,并且在提取的过程中也 不用有毒难闻的药品异戊醇和酪,减少实验对操作者和环境的影响。
[0023] (2)样品研磨采用石英砂巧.4ml提取液+转基因植物叶片共同研磨成匀浆的方 式,可W保证每个样品研磨充分(加入大体积的提取液体2. 4ml,是为了更好的匀浆,加入 石英砂是为了增加摩擦系数),并且适合于大批量、大规模提取转基因植株DNA。
[0024] (3)优化实验步骤,本方案只用氯仿抽提一次即可,不用有毒且难闻的酪和异戊 醇,减少有毒试剂的使用量,降低对环境的污染。
[00巧](4)研磨后吸取匀浆液1ml,而不是常用方法中的600μ以主要是为了增加样品的 量,便于提取更多的DNA,每20min轻摇一次,主要是为了让提取液在水浴过程中与样品的 充分混匀。 阳0%] (5)加氯仿离屯、后,吸取上清液最多0. 7ml,吸取时尽量远离中间层,减少蛋白质 的污染。
[0027] (6)采用0. 7倍体积的异丙醇在-20°C条件下沉淀DNA,20分钟即可,可W缩短实 验操作的时间。
[0028] (7)用酒精洗涂DNA沉淀后,采用再次离屯、Imin的方式将残留酒精完全离屯、到管 底,利用移液枪将其移除,可W加快DNA沉淀中酒精的挥发,节省实验操作时间。
[0029] 做200μL的TE缓冲液溶解沉淀,而不是常规方法中的20-30μL溶解沉淀,可W 充分溶解DNA。
[0030] (9)本方案提取过程中不用液氮,降低实验成本。
[0031] (10)本实验方案中,全部采用常溫离屯、,离屯、速度定为100(K)r/min,降低DM提取 对实验条件的限制,并有助于能耗的降低。
【附图说明】 阳03引图1为本发明方法提取DNA的琼脂糖凝胶电泳图;
[0033] 有关附图标记的说明:
[0034] A-提取拟南芥DNA的琼脂糖凝胶电泳图;B-提取烟草DNA的琼脂糖凝胶电泳图。
【具体实施方式】
[0035] 下面结合实施例对本发明的【具体实施方式】进行详细描述,但应当理解本发明的保 护范围并不受【具体实施方式】的限制。
[0036] 除非另有其它明确表示,否则在整个说明书和权利要求书中,术语"包括"或其变 换如"包含"或"包括有"等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分,而并未排除其它 元件或其它组成部分。
[0037] 连施例1:本发巧转基因植株DNA的提取方法(分别提取转基因拟南芥和烟草各2 株)
[0038] 1. 1主要试剂:提取液2 % CTAB,lOOmmol/L Tris-肥1 (抑8. 0),1. 4mol/L NaCl, lOmmol/L邸ΤΑ ;其他试剂:异丙醇、氯仿、TE缓冲液。
[0039] 1. 2主要仪器:移液枪、离屯、机、水浴锅、冰箱、电泳系统、美国quawellQ3000超微 量紫外分光光度计等。
[0040] 1. 3提取方法包括如下步骤:
[0041] (1)先将2%CTAB提取液置于65°C水浴锅中预热,在使用前摇匀;
再多了解一些
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