[0042] (2)取转基因烟草或拟南芥叶片l-2g置于研鉢中，向研鉢中加入预热后的CTAB提 取液2. 4mU再加入l-2g石英砂，将其研磨成匀浆液，得到匀浆液；
[0043] (3)吸取1.0血匀浆液加入到2血离屯、管中，置于65°C水浴比，每20min轻摇1 次；
[0044] (4)待水浴结束后取出离屯、管，向每管匀浆液中加入0.6mL氯仿，混匀，然后将离 屯、管在常溫、转速为lOOOOr/min下离屯、8min;
[0045] (5)吸取离屯、管中的上清液0. 7血加入到另一个新的2血离屯、管中，再加入0. 5血 的异丙醇，混匀，于-20°C沉淀20min，在常溫、转速为1000化/min下离屯、8min ;
[0046] (6)去除上清，用ImL70%的酒精洗涂沉淀1次，移除酒精，然后在常溫、转速为 1000化/min下离屯、Imin，再用移液枪吸取离屯、管中剩余的酒精，在室溫下放置5-lOmin;
[0047] (7)往离屯、管中加入200μL的TE缓冲液溶解沉淀，摇匀，使之溶解完全，所得溶液 即为转基因烟草或拟南芥DNA提取液，将其置于-20°C下保存，备用。
[0048]对比连施例2:SDS法提取转基因植株DNA的方法（分别提取转基因拟南芥和烟草 各2株）
[0049] 2. 1 主要试剂：提取液 0. 2mol/LTris-HCl(pH7. 5)、0. 5%SDS、0. 25mol/LNaCl、 1 %β-琉基乙醇；其他试剂：异丙醇、氯仿、异戊醇、液氮。
[0050] 2. 2主要仪器：移液枪、离屯、机、冰箱、电泳系统等。 阳05U 2. 3方法，包括W下步骤：
[0052] (1)取新鲜的拟南芥叶片2-3片加入2mL的离屯、管中，加入液氮，玻璃棒研碎； 阳05引似研磨W后，加入600-700化的提取液，混匀，然后在60°C下水浴20-60min ;
[0054] (3) 4°C下12 OOOr/min离屯、lOmin ; 阳化5] (4)取上清液至一新管，加入等体积的氯仿：异戊醇（24 :1)，4°C下12 0(K)r/min 离屯、7min;
[0056] (5)取上清液至一新管，加入70%体积的异丙醇，混匀，4°C下12 0(K)r/min离屯、 15min；
[0057] (6)弃上清，70 %乙醇洗2次沉淀，吹干；
[0058] (7)溶于20-30μL含有0.1 mg/mL RNase的(1地2〇 中。
[0059]对比连施例3:CTAB法提取转基因植株DM的方法（分别提取转基因拟南芥和烟 草各2株）
[0060]3. 1 主要试剂：提取液 2 %CTAB，lOOmmol/LTris-肥 1 (抑8. 0)，1. 4mol/LNaCl， lOmmol/L邸ΤΑ, 2%β-琉基乙醇；其他试剂：异丙醇、酪、氯仿、异戊醇、液氮。
[0061] 3. 2主要仪器：移液枪、离屯、机、冰箱、电泳系统等。 阳06引 3. 3方法，包括W下步骤：
[0063] (1)取1片大小为0. 5cmX 2cm的烟草新鲜叶子用液氮快速冷冻后放置于1. 5mL的 eppendo计管中用末端烧溶合蓝枪头娠碎； W64] 似研磨W后，加入600μL的提取液，颠倒离屯、管数次混匀，然后在65°C下水浴 60min; W65] 做取出后加等体积的酪：氯仿：异戊醇（25:24:1)抽提液，混匀，用邱pendorf·离 屯、机于 4°C，lOOOOr/min离屯、5min。
[0066] (4)将上清液转至新的离屯、管中，加入RNase A至终浓度为1μ邑/111以在37°C下放 置30min。再加入等体积的酪：氯仿：异戊醇（25:24:1)抽提液抽提一次，同样用化pendorf 离屯、机于 4°C，lOOOOr/min离屯、5min ;
[0067] (5)将上清液转至新的离屯、管中，用等体积的氯仿/异戊醇抽提一次。将水相转至 新的离屯、管中，加入1/10体积3mol/L的NaAc(pH5. 2)，3倍体积的100%乙醇后-70°c放 置8~12min，沉淀DNA;
[0068] 化)4°C，lOOOOr/min离屯、lOmin。弃去上清液，用70%乙醇洗涂DNA沉淀两次； W例（7)放置于室溫惊干后，加入20μLTE缓冲液溶解DNA后保存于-20°C用于PCR 实验。
[0070] 表1本发明的提取方法提取转基因拟南芥和烟草DNA的质量和提取率测定
[0071]
阳07引标准DM的分光比值0〇26。/28。应介于1. 8-1. 9之间。如表1所示，本实验方案的两个 实施例1提取的转基因拟南芥和烟草DNA0〇2日。/28。比值分别介于1. 81-1. 89和1. 85-1. 88， DNA得率介于46. 1-50. 09μg和53. 28-58. 18μg之间；而对比实施例2的比值分别介于 1. 66-1. 71 和 1. 59-1. 65,DNA得率介于 6. 1-7. 22μg和 5. 49-6. 25μg之间；对比实施例 3 的比值分别介于5. 65-6. 71μg和4. 65-5. 92μg。因此通过比较可W看出，本实施方法获得 的dm质量高于对比实施例，而DNA得率也远高于对比实施例。
[0073] 综上所述，本发明的提取方法提取的转基因拟南芥和烟草DNA质量和得率都明显 提高，成功率高，非常适合于大规模转基因植株DNA的提取。
[0074] 前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。运些描述 并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可W进行很多改变 和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应 用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案W及 各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
【主权项】
1. 一种转基因植株DNA的提取方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 先将2%CTAB提取液置于65°C水浴锅中预热，在使用前摇匀； (2) 取转基因烟草或拟南芥叶片l_2g置于研钵中，向研钵中加入预热后的CTAB提取液 2. 4mL，再加入l-2g石英砂，将其研磨成匀浆液，得到匀浆液； (3) 吸取1.OmL匀浆液加入到2mL离心管中，置于65°C水浴lh，每20min轻摇1次； (4) 待水浴结束后取出离心管，向每管匀浆液中加入0. 6mL氯仿，混匀，然后将离心管 在常温、转速为l〇〇〇〇r/min下离心8min; (5) 吸取离心管中的上清液0. 7mL加入到另一个新的2mL离心管中，再加入0. 5mL的异 丙醇，混勾，于-20°C沉淀20min，在常温、转速为10000r/min下离心8min; (6) 去除上清，用lmL70%的酒精洗涤沉淀1次，移除酒精，然后在常温、转速为 10000r/min下离心lmin，再用移液枪吸取离心管中剩余的酒精，在室温下放置5-10min; (7) 往离心管中加入200μL的TE缓冲液溶解沉淀，摇匀，使之溶解完全，所得溶液即为 转基因烟草或拟南芥DNA提取液，将其置于-20°C下保存，备用。
【专利摘要】一种转基因植株DNA的提取方法，包括以下步骤：(1)先将CTAB提取液预热；(2)取转基因植株叶片置于研钵中，将其研磨成匀浆液；(3)吸取匀浆液加入到离心管中，水浴，轻摇；(4)待水浴结束后取出离心管，向每管匀浆液中加入氯仿，混匀，然后将离心管在常温下离心；(5)吸取离心管中的上清液加入到新的离心管中，再加入异丙醇，混匀，沉淀，离心；(6)去除上清，用酒精洗涤沉淀，移除酒精，然后在常温下离心，再用移液枪吸取离心管中剩余的酒精，在室温下放置；(7)往离心管中加入的TE缓冲液溶解沉淀，摇匀，溶解完全，即得转基因植株DNA提取液。本发明的提取方法得到DNA的质量和得率都大大提高，适合于大规模转基因拟南芥或烟草DNA的提取。
【IPC分类】C12N15/10
【公开号】CN105368814
【申请号】CN201510785699
【发明人】罗聪, 余海霞, 何新华
【申请人】广西大学
【公开日】2016年3月2日
【申请日】2015年11月16日