一种光头稗的gtb-hm基因及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种禾本科植物一-光头碑编码高蛋氨酸蛋白的GTB-HM基因，属于分 子生物学技术领域。
【背景技术】
[0002] 蛋白短缺尤其是优质蛋白的短缺，是21世纪全球性的严重问题，在尽快提高作物 品种的蛋白质含量的同时，积极改善蛋白质的氨基酸组成，提高限制性氨基酸的含量W增 强其营养价值，具有重要意义。植物种子储藏了丰富的蛋白质、碳水化合物和脂类，其中胆 藏于蛋白质体内的胆藏蛋白是植物种子的主要成分，其功能不仅局限于为种子的正常萌发 和幼苗生长提供营养供给，而且也参与了种子萌发和发育过程的调控（赵文明，1995)。
[0003] 硫是仅次于氮、憐、钟的植物必需的第4大营养元素，缺硫时蛋白质合成受阻，导 致非蛋白氮累积，不仅影响作物生长，而且降低农产品品质；植物含硫量为0. 1%~0. 5%， 其变幅明显受植物种类、品种、器官和生育期的影响。十字花科植物需硫最多，豆科、百合 科植物次之，禾本科植物较少（陆景陵，1994)。含硫氨基酸如甲硫氨酸（也称为蛋氨酸， methionine,Met)、脫氨酸、半脫氨酸（cysteine,切S)等是合成蛋白质的重要氨基酸；蛋白 质中含硫氨基酸的含量与种子萌发、生长和作物品质均有密切关系。其中，Met作为人体和 单瘤胃动物的必需氨基酸之一，在水稻、小麦、大麦、养麦，尤其是豆类和花生等主要的粮食 作物和经济作物中含量极低，是主要的限制性氨基酸，因此提高运些作物的Met含量显得 尤为重要（赵文明，1995;MilntzK，1998)。
[0004] 随着现代生物技术的发展，通过扩大筛选获得更多高含硫氨基酸的目的基因，利 用蛋白质组学的方法掲示高Met种子胆藏蛋白新的功能（王文军等，2005)，结合植物基因 工程的手段改良作物品质、调节种子生长发育等将更具实际意义化aftBΚ，2005)。
[0005]目前国际上已经分离出来可供用来提高作物Met含量的高Met植物种子胆藏蛋白 基因为数不多，其主要来源是玉米（AltenbachSB，1990)和水稻（Masum-uraΤ，1989)，此 外还有少部分来自己西栗6日日化日油1，1994)、花生度日3}1日8 1，1994)等，我国尤其落后， 因而充分利用我国丰富的种质资源，合理与有效的发掘和利用植物资源，分离提取有价值 的高Met植物种子胆藏蛋白基因是W提高作物Met含量为目的品质改良基因工程领域迫切 需要的基础性工作，也将为高Met植物种子胆藏蛋白的研究开辟新的领域。
【发明内容】
[0006] 本发明提供一种编码高蛋氨酸蛋白的光头碑基因GTB-HM及其编码高蛋氨酸蛋白 的应用；该基因能提高相关蛋白的表达，尤其是能够提高植物中蛋氨酸的含量。
[0007] 本发明通过设计出引物，W光头碑DNA为模板，PCR扩增得到该基因全长序列，经 T载体克隆并测序，再转入大豆进行强表达，表明运是一条编码高蛋氨酸蛋白的基因。该基 因编码区为40化P，编码135个氨基酸，其中含有13个蛋氨酸，并且在该蛋白中蛋氨酸的摩 尔百分含量达到9. 62%。
[0008] 因此，本发明第一个目的是提供一种编码高蛋氨酸蛋白的光头碑基因GTB-HM，其 属于新的编码高蛋氨酸蛋白基因，具有或选自SEQIDNO: 1的序列。或与SEQIDNo: 1限 定的核巧酸序列具有90%W上同源性的核巧酸序列；在高严谨条件下可与SEQIDNo: 1限 定的DM序列杂交的核巧酸序列。
[0009] 本发明第二个目的是提供所述基因所编码的功能蛋白，其具有或选自SEQID N0:2的蛋白序列，或具有或选自SEQIDNO: 1的基因序列所编码的蛋白序列。或与SEQID No:2的氨基酸残基序列经过一至十二个氨基酸残基的取代或缺失或添加且对植物的生长 发育具有调控作用的蛋白质。
[0010] 本发明第Ξ个目的是提供所述基因或功能蛋白，在调控光头碑高蛋氨酸蛋白表达 中的用途；利用该基因，开发更高效、无毒的光头碑来源的具有高蛋氨酸蛋白的功能型食用 蛋白乃至保健品。
[0011] 在具体实施方案中GTB-HM基因及其调控元件的表达载体。
[0012] 在具体实施方案中GTB-HM基因及其调控元件的转基因细胞系。
[0013] 在具体实施方案中GTB-HM基因及其调控元件的工程菌。
[0014] 在具体实施方案中GTB-HM基因及其调控元件中任一片段的引物对。
[0015] 在具体实施方案中GTB-HM基因及其调控元件中在植物生长发育中的应用。
[0016] 在具体实施方案中GTB-HM基因及其蛋白可应用于植物包括单子叶植物和双子叶 植物。
【附图说明】
[0017] 图1为PCR基因扩增结果（1为光头碑PCR扩增产物，Μ为DNAMarker)。图2为 酶切结果（1为提取的重组质粒，2为重组质粒酶切产物，Μ为DNA
[001引Marker)。
[0019]图3 pCAMBIA1390重组质粒中连接示意图（X. Japoni州SUbiquitin promoter PCAMBIA1390)，其中GTB-HM为光头碑高蛋氨酸基因。
[0020] 技术效果
[0021] 1、利用本发明的GTB-HM基因表达得到含有13个蛋氨酸的蛋白质，有助于蛋氨酸 在大豆中的含量。
[0022] 2、利用本发明的GTB-HM基因基因和蛋白，可用于已有局蛋氨酸蛋白的研究和应 用中，W及开发高效、无毒的高蛋氨酸蛋白的功能型的蛋白质乃至保健品。
【具体实施方式】
[0023] 在本发明的下述实施例中，所用的实验材料均为光头碑巧chinochloa crusgalli L. Be曰uv. )ο
[0024] 实施例1、光头碑总RNA提取
[002引利用RNA提取分离试剂盒化vitrogen公司提供）提取光头碑巷片中总RNA，其 具体方法是：收集光头碑巷片lOOmg，立即置于液氮中研磨，加入1mlTrizol试剂，充分混 匀；室溫放置5min;加入0. 2ml新鲜氯仿，剧烈振摇15s，室溫溫育3min;4°C，12000g离屯、 15min;上清水相转移到一个新的1. 5ml离屯、管中，加入0. 5ml异丙醇沉淀RNA;RNA沉淀用 1ml75%乙醇洗涂后溶于适量DEPC处理过的水中，-70°C保存备用。
[0026]实施例2、光头碑总RNA纯化
[0027] 依据測aseI试剂盒（ThermoScientific公司提供）依次向实施例1获得的光 头碑总RNA中加入6μ1DEPC处理水、10μ1 ΚΝΑ、2μ1面aseIBuffer、2yl面aseI，混 合均匀后，37°C30min，加入邸ΤΑ 2μ1，65ΓlOmin。
[002引实施例3、光头碑RNA逆转录
[0029]第一链合成：依据PlantRT-PCRKit2.01aaKaRa，Japan)的用户手册进行。 l-2ng总RNA(大约1-2μ1)，和Kit的各种反转录试剂混合（MgCMμ1 ; 10XRNAPCR Buffer2μ1;RNaseInhibitor0.5μ1;RNasefreeWater8.5μ1;dNTPMi;rture2μ1; ReverseTranscriptase1μ1 ;01igodT-Adaptor1μ1)。匀后，42°C30min;99°C5min; 5° °C5min，完成反转录反应。
[0030] 第二链合成：根据生物信息学提供的序列资料设计W下引物：
[0031] 5,端引物（SEQIDNO:3)：5'-CGGGATCCCGATGGCAGCCAAGATGCTTGC-3'；
[0032] 3,端引物（SEQIDNO:4):5'-CGAGCTCGCTAGAATGCAGCACCAACAAAGGG-3'。
[0033] 吸取1 μ 1反转录产物，作为模板与DMTaq酶混合（反转录产物1 μ 1，上游引 物（沈QIDΝ0:：3)0. 5μ1，下游引物（沈QIDΝ0:4)0. 5μ1，Taq0. 5μ1，10ΧBuffer2yl， Mg2+0. 5 μ l，d地2〇15 μ 1)进行PCR反应：94°C 5min后进入扩增程序：94°C lmin、57°C Imin、 72°C Imin, 30个循环后，72°C 5min。
[0034] 实施例4、TA克隆
[003引将实施例3中所获得的PCR扩增产物，经琼脂糖电泳（图2)分离目的DM片段， 采用胶回收DNA试剂盒（购自上海生工生物工程有限公司）方法进行回收DNA片段，将回 收的第二链合成产物与DNA克隆试剂混合（第二链产物6μ1，阳G40001μ1，T载体1μ1， 10Χligationbuffer1μl，ligase1μ1)，于 16°C连接过夜。
[0036] 实施例5、转化大肠杆菌和目的DNA片段测序
[0037] 取连接产物5 μ 1与200 μ 1大肠杆菌D册α感受态细胞（购自上海生工生物工程 有限公司）混匀，冰上放置30min，42°C 90s，冰浴1-2分钟，加入800 μ 1 LB培养基，于37°C， 250巧m震荡培养45min，4000巧m离屯、5min，上清留下约150μ1，加入7μ1 IPTG，40yl x-gal混合均匀，涂布于预先加入Amp(氨节青霉素）的LB固体培养基上培养过夜，挑取白 色菌落于加有Amp的LB液体培养基中震荡过夜，取1ml菌液送至上海生工生物工程有限公 司测序。测序结果表明：扩增得到的序列SEQ ID NO: 1自起始密码子到终止密码子总长390 碱基，编码129个氨基酸，推测分子量为14. 2kD，等电点8.74,编码蛋氨酸17个，蛋氨酸的 百分摩尔含量为13. 18%。
[003引实施例6、将目的DNA片段导入大豆中进行强表达
[0039] 从上述含有GTB-HM基因的菌液中提取质粒，用甜aI和BamHI进行双酶切，酶切 产物经回收后，与同样经甜aI和BamHI双酶切回收的PCAMBIA1390质粒进行连接，构建 重组质粒（如图3);将重组质粒转化根癌农杆菌AGL1，通过Kan和Rif筛选出转化成功的 AGL1菌株，并将其侵染大豆（购自南京农业大学国家大豆种质资源中屯、）子叶节，利用潮霉 素筛选获得GTB-HM基因转染成功的大豆幼苗，并经培养获得大豆种子，通过氨基酸分析仪 检测大豆种子Met含量，发现其Met含量由对照的0. 651%提高至3. 968%，表明GTB-HM基 因在大豆中得到了强表达。
[0040] 沈Q ID NO: 1基因序列表如下：
[0041]
[0042] 沈Q ID NO:2氨基酸序列表如下：
[0043]
[0044]
【主权项】
1. 一种光头稗的GTB-HM基因及其应用，其特征在于为下述核苷酸序列之一的基因： (1)SEQIDNo:l； (2) 与SEQIDNo: 1限定的核苷酸序列具有90%以上同源性的核苷酸序列； (3) 在高严谨条件下可与SEQIDNo: 1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。2. 权利要求1所述GTB-HM基因表达的蛋白质，其特征在于为下述氨基酸残基序列之 (1)SEQIDNo:2 ； (2)SEQIDNo:2的氨基酸残基序列经过一至十二个氨基酸残基的取代或缺失或添加 且对植物的生长发育具有调控作用的蛋白质。3. 含有权利要求1所述的GTB-HM基因及其调控元件的表达载体。4. 含有权利要求1所述的GTB-HM基因及其调控元件的转基因细胞系。5. 含有权利要求1所述的GTB-HM基因及其调控元件的工程菌。6. 扩增权利要求1所述的GTB-HM基因及其调控元件中任一片段的引物对。7. 权利要求1所述的GTB-HM基因及其调控元件中在植物生长发育中的应用。8. 根据权利要求7所述的应用，所述的植物包括单子叶植物和双子叶植物。9. 根据权利要求1或2所述的应用，在调控光头稗高蛋氨酸蛋白表达中的用途；利用 该基因，开发更高效、无毒的光头稗来源的具有高蛋氨酸蛋白的功能型食用蛋白乃至保健 品。
【专利摘要】本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种编码光头稗高蛋氨酸蛋白的基因GTB-HM及其编码蛋白与应用。该基因能大大促进蛋白质合成，降低非蛋白氮含量，不仅促进作物生长，而且提高农产品品质，具有较高的实际应用价值。
【IPC分类】C12N15/11, C12N15/82, A01H5/00, C12N1/21, C12N15/63, C12N15/29, C07K14/415, C12N15/70
【公开号】CN105368845
【申请号】CN201510922400
【发明人】陈宏伟
【申请人】向华
【公开日】2016年3月2日
【申请日】2015年12月11日