水稻类病斑突变基因lil1及应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及基因工程领域，具体设及一种水稻类病斑突变基因，同时设及该基因 在稻攝病菌抗性中的应用。
【背景技术】
[0002] 稻攝病是世界性的重要水稻病害，在水稻的整个生育期均可造成危害，一般情况 减产10% -20%，重的达40-50%，甚至颗粒无收。近年来，稻攝病年发生面积呈现逐年增加 趋势，局部大爆发也不少见。栽培抗病品种是生产上防治稻攝病最经济有效的途径，因此发 掘新的稻攝病抗性基因对水稻的抗病育种意义重大。
[0003] 过敏性坏死反应化ypersensitiveresponse,HR)是植物对抗病原物侵染的一种 自我保护机制。过敏性坏死反应发生时，受感染部位及其周围的寄主细胞能快速发生细胞 程序化死亡（ProgrammedCellDeath,PCD)，形成坏死斑，限制病原物进一步扩展，从而达 到抗病的作用。植物类病斑突变体（lesionmimicmutant,LMM)是一类在没有明显逆境、 损伤或病原物侵染的条件下，能在植株上自发形成坏死斑的突变体，运些突变体的表型与 HR相似，表现出明显的细胞程序化死亡现象。很多类病斑突变材料在坏死斑形成之前或之 后可表现局部或系统的抗性。如水稻spill突变体表现出稻攝病菌（真菌）和水稻白叶枯 病菌（细菌）的双重抗性；水稻spll突变体激活抗病基因PBZ1的表达，对稻攝病菌的不同 生理小种均有抗性。因此，尽可能多的发现和克隆水稻类病斑突变基因是寻找稻攝病抗性 基因的有效途径。
[0004] 近年来应用分子遗传学的手段，已经发现和克隆了部分水稻中类病斑突变体的突 变基因，其中一些的确与稻攝病的抗性相关。比如水稻Spill和水稻Spll8基因都能增强 植株对稻攝病的抗性，水稻Sekiguchi类病斑突变体在光照条件下能提高植株对稻攝病菌 的抗性。
【发明内容】
阳〇化]本发明的目的在于提供一种新的水稻类病斑突变基因，该突变基因激活了水稻抗 病相关基因的表达，并对稻攝病菌的抗性显著增强。
[0006] 本发明人从釉稻品种93-11EMS诱变群体中发现一个类病斑突变体，命名为 LIL1 (Li曲t-induced-lesionmimicmutant1)。该突变体类病斑的形成和发展是一个类 似过敏反应的细胞程序化死亡过程。抗病相关基因PR1、PR-lOa、P0C-1和P0X22. 3基因 在LIL1体内的表达量相对野生型93-11明显增加，且突变体对稻攝病菌的抗性显著增强。 通过图位克隆的方法，将LIL1基因精细定位于水稻7号染色体222. 3化的范围内，目前定 位或克隆的水稻类病斑突变基因无一位于定位区域，因此运是一个新的水稻类病斑突变基 因。对定位区域内的基因进行了测序，发现一个编码Tyr受体类激酶的基因，在突变体LIL1 中存在一个核巧酸的变异，导致该基因编码蛋白质的第429号氨基酸由鄉氨酸变成了异亮 氨酸，其氨基酸序列如SEQID齡.2所示。采用^斗〇?技术克隆1比1基因的〔05编码区 序列（如SEQIDNo. 3所示），并构建了超表达载体，通过转基因验证，确定该突变的Tyr受 体类激酶的基因为LIL1基因，其序列如SEQIDNo. 1所示。
[0007] 本发明LIL1基因的表达可显著增强了水稻对稻攝病菌的抗性，该基因的发现和 克隆为水稻抗稻攝病的抗性育种提供了新的基因资源。
【附图说明】
[0008] 图1是突变体LIL1的表型图。
[0009] 其中，A:大田条件下突变体LIL1的表型，1 :突变体LIL1植株，2 :野生型93-11 ; B:突变体LIL1老叶与新叶对比，1 :老叶，2 :新叶；C:无菌条件下突变体LIL1的表型；D:突 变体LIL1遮光处理的表型。
[0010] 图2是LIL1基因对稻攝病的抗性影响图。
[0011] 图3是LIL1基因精细定位图。
[0012] 图4是候选基因在突变体LIL1和野生型93-11内的表达情况。
[0013] 图5是LIL1基因的突变位点测序峰图。
[0014] 其中，A:LIL1;B:野生型 93-11。
[0015] 图6是LIL1蛋白突变位置。
[0016] 图7是LIL1基因全长cDNA的RT-PCR结果电泳图。
[0017] 其中，Μ:marker500bpDNAladder;1 :LIL1 基因。
[0018] 图8是LILl基因超表达载体的构建结果电泳图。
[0019] 其中，Μ:marker化bDNAladder;1、2 :LIL1基因超表达载体；3、4 :超表达载体的 酶切结果。
[0020] 图9是转基因植株潮霉素检测结果图。
[0021] 其中，Μ:markerDL2000 ;1-24 :转LIL1 基因植株；1、3、6、8、10、14、17、19、20、21、 23、24为阳性。
[0022] 图10是LIL1抗性相关基因的表达图。 阳02引其中，A、C:3叶期；B、D:灌浆期。
[0024] 图11是转LIL1基因水稚对稚攝病的抗性增强图。
【具体实施方式】
[0025] 实施例1突变体LIL1的表型鉴定 阳0%] 结合参见图1，将突变体LIL1植株与野生型93-11进行比较，可知，突变体LIL1植 株较野生型明显矮化（图1A)，类病斑3叶期始现，类似过敏反应坏死斑。老叶上的斑点较 新叶多且密（图1B)，无菌环境下同样表现出类病斑（图1C)。光照对类病斑的形成有影响， 锡锥纸遮光处理的部位类病斑明显较未遮光处少（图1D)。
[0027] 突变体LIL1对供试稻攝病菌有明显抗性（图2)。
[0028] 实施例2LIL1突变基因的定位与候选
[0029] 利用图位克隆的方法将LIL1基因精细定位于水稻7号染色体222. 3化的范围内 (图3)，通过基因表达差异分析（图4)和测序，发现一个编码Tyr受体类激酶的基因在突 变体LIL1中存在一个核巧酸的变异（图5)，导致该基因编码蛋白质的第429号氨基酸由鄉 氨酸变成了异亮氨酸，且突变的位点刚好位于激酶的催化结构域中（图6)。多个品种栽培 稻和野生稻运一位点的测序结果说明该位点在自然进化的过程当中相当保守。据此推测该 突变为EMS诱变产生。
[0030] 实施例3LIL1突变基因的CDS克隆及测序 阳03U 根据LIL1基因序列设计引物，引物序列如下：
[0032] LIL1-F，CAGGTACC|ATGGCCATTTTGACCGTTCTGCC(如沈QIDNo. 4 所示）
[0033] LIL1-R，CTGGATCC|TTACCTGCCGTTCACAATTGTTATGG(如沈QIDNo. 5 所示）。
[0034] 为了方便克隆入表达载体，引物序列前加入了相应酶切位点（下划线）的序列， RT-PCR克隆LIL1基因的CDS编码区（图7)。
[0035] 具体操作过程如下：
[0036] (1)植物RNA的提取
[0037] 取突变体LIL1 3叶期全株为材料提取RNA，步骤如下：
[0038] 1)收集100-200mg组织，用液氮将组织材料充分研磨成粉末；
[0039] 2)待液氮挥发后，将粉末迅速转移至化ase化ee离屯、管，立即加入1ml的Trizol 提取液，盖紧管盖，满旋震荡30s，使样品充分混匀，室溫放置5min; W40] 如加入0. 2ml氯仿剧烈振荡混匀1