一种fgfr3突变体的重组表达载体及其构建方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，设及一种FGFR3突变体的重组表达载体及其构建方法 和应用。
【背景技术】
[0002] 慢性肝脏疾病是危害我国人民健康的重大公共卫生问题之一，在我国导致死亡的 主要原因中占第六位，人群中乙型肝炎病毒皿V携带率为9. 09%，其中慢性乙型肝炎患者 约5000万，肝脏炎症的反复发作导致10%~20%的患者发展为肝硬化，其中10%~15% 的肝硬化患者最终发展为肝细胞肝癌。除了肝癌的危害W外，肝炎一肝硬化一肝癌的转化 过程中的各个阶段都会对患者的健康和生命造成严重危害，对我国产生了沉重的经济负担 和社会问题。目前有关乙型肝炎一肝硬化一肝癌病变机制的研究主要包括乙肝易感因素的 研究、疫苗保护效率和失败原因、慢乙肝抗病毒治疗反应的宿主细胞的反应、导致肝纤维化 和肝硬化进展的宿主因素、肝癌发生发展的遗传及环境因素等。在临床诊断和治疗方面，我 国目前尚缺乏有效、特异、具有指导性意义的分子标识物，W及相应的诊断、治疗及其预后 检测手段，尤其在特异性药物的研究方面更是严重地滞后。
[0003] 申请人于2014年7月23日申请了发明名称为"一种肝癌组织中FGFR3的新型剪 接变异体及其应用"，专利【申请号】201410353903. 8,表明该FGFR3新型变异体能作为肝癌 的诊断标志物。但是，目前尚未有FGFR3突变体的重组表达载体及其构建方法和应用的具 体报道。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题之一是提供一种FGFR3突变体的重组表达载体。
[0005] 本发明要解决的技术问题之二是提供一种FGFR3突变体的重组表达载体的构建 方法。
[0006] 本发明要解决的技术问题之Ξ是提供一种FGFR3突变体的重组表达载体的应用。
[0007] 具体而言，在本发明的第一方面，提供了一种FGFR3突变体的重组表达载体，其特 征在于：它含有缺失外显子7、8和9的突变体FGFR3Δ7-9,所述突变体FGFR3Δ7-9缺失的 核巧酸序列如SEQIDNO. 1所示。FGFR3突变体的序列与野生型FGFR3相比，大部分是一致 的，只有7-9运部分序列（如SEQIDNO. 1所示）在突变体中是缺失的，本发明主要也是侧 重于运部分缺失的序列（如SEQIDNO. 1所示）。
[000引此外，本发明还提供一种包含上述重组表达载体的转化体。
[0009] 在本发明的另一方面，提供一种所述FGFR3突变体的重组表达载体的构建方法， 包括如下步骤：（1)采用搭桥法扩增FGFR3突变体的DNA片断；（2)扩增产物凝胶电泳后行 目的基因切胶回收；（3)PCR产物双酶切；(4)连接目的片段和载体片段。
[0010] 作为本发明优选的技术方案，步骤（1)具体为：
[0011] 第一，设计PCR引物：
[0012]FGFR3_F5'-gacGGATCCatgggcgcccctgcctgcgccctc-3 '，如沈QIDNO. 2 所 示；反义链：FGFR3-R5 '-gacACTAGTtcacgtccgcgagcccccactgct-3 '，如沈QIDNO. 3 所示；
[0013] F(linker7,8, 9):c邑tacac邑ct邑邑ac邑t邑ct邑邑ct邑a邑邑a邑邑a邑ct邑at邑邑aaa，女曰SEQID NO.4所;^ ;R(linker7,8, 9):tttccatca邑ctcctcctca邑cca邑cac邑tcca邑c邑t邑tac邑，女曰SEQID NO. 5所示；
[0014] 第二，通过配对引物尸6尸33斗和1?(11111?5巧，8,9);尸6尸1?3-1?和尸（1山1?5巧，8,9)分 另IjPCR扩增出A,B两个DM片段；
[001引第S，A和B两个DM片段通过引物F(linker7,8,9)和R(linker7,8,9)的末端 将两个片段拼接起来；拼接好的产物作为PCR扩增的模板，WFGFR3-F和FGFR3-R引物进行 扩增。
[0016] 作为本发明优选的技术方案，步骤（1)的第Ξ步中，拼接体系如下：
[0017] KODbuffer, 3μ1;
[001 引A片段，8. 5μ1;
[0019] Β片段，17μ1;
[0020]Κ孤plus,0.5μ1;
[002。 加水补足30μ1;
[002引反应条件：94°C变性5分钟；55 °C退火3分钟，68 °C延伸15分钟。
[0023] 作为本发明优选的技术方案，步骤（3)中，所述PCR产物双酶切按照如下反应体 系：
[0024] ddH20 33μL 10XBuffers 弓w:L PCR产物（如g)或质粒DNA(lug)Ι?μΙ Β蝴HI 1：μΙ SpeIIwL Total 就μL
[00巧]于37°C水浴锅反应4小时，将全部酶切产物行1.0%琼脂糖凝胶电泳，从胶上切取 目的基因片段，放入EP管称重，进行胶回收。
[0026] 作为本发明优选的技术方案，步骤（4)中，步骤（3)双酶切获得目的基因和pWPI. 1 载体连接转化；取一灭菌0. 2mLEP管，加入W下反应体系：
[0027] d曲 20 BpL
[0028] pWPI. 1 2pL FGFR3 10μL T4Buffer2μL T4连接酶 1μL Total 20μL 于16Γ连接过夜。
[0029] 作为本发明优选的技术方案，将构建好的所述重组表达载体导入宿主细胞，所述 宿主细胞为感受态细菌。
[0030] 在本发明的另一方面，还提供所述重组表达载体的应用，包括其在鉴定FGF1/FGF2 和FGFR3及其突变体的亲和力中的应用，在鉴定FGFR3及其突变体形成二聚体的能力中的 应用，W及在鉴定FLAG-FGFR3IIIc、FLAG-FGFR3Δ7-9和FLAG-FGFR3AT-I酪氨酸激酶区的 激活中的应用。
[0031] 本发明说明书的术语解释如下：
[0032] "FGFR3突变体":FGFRs基因存在可变剪切位点，不同剪切体与配体的亲和力不 同，有各自的优势结合配体，越来越多的证据显示，FGFRs异常的剪切变异事件在肿瘤中 发挥着重要的作用。
[0033]"重组质粒与表达载体"：通过相关酶的作用，使目的基因与质粒二者相互结合，从 而构成重组质粒。使目的基因能够进入细胞并发挥相关功能的运载体即为表达载体，包括 目的基因、启动子、终止子、标记基因四个部分，常用细菌质粒进行构建。
[0034]"搭桥法":即重叠延伸PCR技术（genesplicingbyoverlapextensionPCR,简 称SOE PCR)，采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反 应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来.此技术利用PCR技术能够 在体外进行有效的基因重组，而且不需要内切酶消化和连接酶处理，可利用运一技术很快 获得其它依靠限制性内切酶消化的方法难W得到的产物.重叠延伸PCR技术成功的关键是 重叠互补引物的设计.重叠延伸PCR在基因的定点突变、融合基因的构建、长片段基因的合 成、基因敲除W及目的基因的扩增等方面有其广泛而独特的应用。
[0035]"宿主细胞":病毒侵入的细胞就叫宿主细胞。病毒一般没有成型的细胞核，一般被 蛋白质所包裹在里面的是它的遗传物质，在病毒获得宿主后，利用宿主的蛋白质和其他物 质制造自己的身体，然后将遗传物质注入到细胞内部感染细胞。
[0036]"亲和力"：生物高分子合配基之间形成中间复合物的能力叫做亲合力 (Affinity)。两个分子在多个部位结合强度的总和。免疫学上指多价抗体与抗原间亲和力 的总称。
[0037]"形成二聚体的能力":FGFR3和FGFRs结合形成复合物的过程需要有硫酸肝素糖 蛋白与细胞膜的结合，既而引起FGFR3二聚体的形成，促使FGFR3胞内酪氨酸激酶酪氨酸 残基的自身憐酸化，激活了酪氨酸激酶活性。FGFR3单体形成二聚体时所表现出的结合能 力。
[003引"酪氨酸激酶区":FGFR3主要由胞外区、跨膜区和胞内区Ξ部分组成，其中的胞内 区是酪氨酸蛋白激酶的催化部位，并具有自憐酸化位点。
[0039] 本发明的有益效果在于，本发明采用搭桥法扩增FGFR3突变体的DNA片断；通 过扩增产物凝胶电泳后行目的基因切胶回收、PCR产物双酶切、连接目的片段和载体片段 构建FGFR3突变体的重组表达载体；通过实验显示，该重组表达载体在鉴定FGF1/FGF2 和FGFR3及其突变体的亲和力中、鉴定FGFR3及其突变体形成二聚体的能力中，W及鉴定 FLAG-FGFR3IIIC、FLAG-FGFR3Δ7-9和FLAG-FGFR3AT-I酪氨酸激酶区的激活中，具有表达 效率高、表达稳定、转染效率高等优点，具有良好的应用价值。可用于研究FGFR3突变体在 诊断肝癌中的作用。
[0040]W下将通过具体的实施例和附图对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是， 运些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发 明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见了。
【附图说明】
[0041] 图1是本发明实施例1中采用搭桥法构建FGFR3突变体的示意图。
[0042] 图2是本发明实施例1的pWPI. 1-FGFR3-IRES2-EGFP及其突变体重组质粒双酶切 后的琼脂糖凝胶电泳结果。其中，Μ为Marker。
[0043] 图3是本发明实施例1中重组质粒序列的分析鉴定示意图。
[0044] 图4是本发明实施例1中检测FGF1/FGF2和FGFR3及其突变体的亲和力的示意图。
[0045] 图5是本发明实施例2中FGF1-FGFR3亲和力曲线示意图。
[0046] 图6是本发明实施例2中FGF1-FGFR3Δ7-9亲和力曲线示意图。
[0047]图7是本发明实施例3中非变性胶检测FLAG-FGFR3IIIC、FLAG-FGFR3Δ7-9和 FLAG-FGFR3AT-I自身形成二聚体的能力的示意图。
[0048]图 8 是本发明实施例 3 中SDS-PAGE胶鉴定FLAG-FGFR3IIIc、FLAG-FGFR3Δ7-9 酪 氨酸激酶区的激活的示意图。
【具体实施方式】
[0049]W下通过具体的实施例进行示例，其中所用试剂均可通过市场渠道购买，如有未 尽之处，可W参考相应的PCR和基因测序的实验手册。
[0050] 实施例1重组表达载体的构建
[005。一、pWPI. 1-FGFR3IIIC-IRES2-EGFP、pWPI. 1-FGFR3AT-I-IRES2-EGFP及pWPI. 1-FGFR3Δ7-9-IRES2-EGFP载体构建和pcDNA3. 0-化AG-FGFR3, pcDNA3. 0-HA-FGFR3， pcDNA3. 0-FLAG-FGFl，pcDNA3. 0-HA-FGFl，pcDNA3. 0-FLAG-FGF2，pcDNA3. 0-HA-FGF2载体构 建（W上载体均为FGFR3野生型IIIc、FGFR3突变体AT I和突变体Δ7-9-相关载体的构 建，W及一些实验中标签蛋白的载体构建）