一种丙酮酸生产强度提高的重组菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种丙酬酸生产强度提高的重组菌及其应用，属于发酵工程技术领 域。
【背景技术】
[0002] 丙酬酸（pyruvate)是生物代谢的中间产物，处于各代谢途径的中间环节，如：是 糖酵解的终产物；通过脱氨脱簇反应转化为TCA循环的起始物质乙酷-CoA;在丙酬酸簇化 酶作用下生成TCA循环的中间产物草酷乙酸；通过转氨基作用生成丙氨酸等，同时也是非 常重要的酬酸之一。由于丙酬酸是多种物质的合成前体，目前社会对丙酬酸的需求量日益 增加，其广泛的应用于日化，食品，医疗，农业等行业。
[0003] 丙酬酸的生产方法主要有化学合成法和微生物发酵法两大类。化学合成法主要有 酒石酸法、乳酸乙酷空气氧化法、经基丙酬法、电化学合成法、乳酸催化氧化法。目前丙酬酸 的生产正在W前的化工合成转向通过微生物发酵制备。微生物发酵法相对于化工合成有更 多的优点，如原料的转化率高，污染小，成本低等优点。
[0004]目前，微生物发酵法生产丙酬酸作为一种替代性的绿色环保方法成为了国内外研 究的热口。而要通过微生物发酵获得高产丙酬酸，其中最关键是要有一株高产并且高生产 强度的丙酬酸菌株。目前对高产丙酬酸菌株的改造主要集中在对代谢途径中的某些关键酶 进行过表达和一些旁路途径进行敲出。
[0005]目前，微生物发酵法生产丙酬酸作为一种替代性的绿色环保方法成为了国内外研 究的热口。而要通过微生物发酵获得高产丙酬酸，其中最关键是要有一株高产并且高生产 强度的丙酬酸菌株。目前对高产丙酬酸菌株的改造主要集中在对代谢途径中的某些关键酶 进行过表达和一些旁路途径进行敲出。对通过怎么去加强丙酬酸出细胞的研究，则鲜有文 献报道。
【发明内容】
[0006] 为了解决上述问题，本发明通过定位表达线粒体丙酬酸载体于细胞膜上，加强丙 酬酸出细胞的速率而缓解丙酬酸对糖酵解途径中关键酶的抑制作用，从而提高丙酬酸发酵 产量和发酵强度。
[0007] 本发明的第一个目的是提供一种产丙酬酸重组菌，所述重组菌过表达线粒体丙酬 酸载体蛋白MPC1基因，所述MPC1基因连接有序列为SEQIDNO. 1的信号肤。
[0008] 在本发明的一种实施方式中，所述MPC1基因是NCBI上Gene10:852800的MPC1。
[0009] 所述重组菌是W缺失了Ura基因的光滑球拟酵母T.gl油rataCCTCCM202019为 宿主，表达连接有信号肤的NCBI上Gene10:852800的MPC1。
[0010] 在本发明的一种实施方式中，所述MPC1基因是W酿酒酵母菌株N85基因组为模板 扩增得到的。
[0011] 所述过表达是W酵母表达质粒ρΥ26(购自德而宝公司）为载体。
[0012] 在本发明的一种实施方式中，所述信号肤和MPCl基因通过BamHI酶切位点连接。
[0013] 在本发明的一种实施方式中，所述重组菌是W缺失了化a基因的T.gl油rata CCTCCM202019为宿主、ρΥ26为载体表达连接有信号肤的NCBI上Gene10:852800的MPC1。
[0014] 在本发明的一种实施方式中，所述重组菌的构建：
[001引 （1)将目的片段MPC1经过限制性内切酶EcoRI和XamI双酶切消化后，并将MPC1 定向克隆到表达质粒ρΥ26中，得到重组酵母表达质粒PY26-MPC1;
[001引 （2)将序列为沈QIDNO. 1的信号肤S虹ewlp用BamHI和XmaI双酶切消化后连 接到被BamHI和XmaI双酶切消化的PY26-MPC1上将，得到重组质粒PY26-S虹ewlp-MPCl;
[0017] (3)重组质粒pY26-S虹ewlp-MPCl电转化受体菌T.gl油rata CCTCCM202019灯排），在不含尿喀晚的培养基中进行筛选，得到重组菌 T排（pY26-airewlp-MPCl)。
[0018] 在本发明的一种实施方式中，所述酵母表达质粒ρΥ26为大肠杆菌-酵母之间的穿 梭载体，在大肠杆菌中选择标记为ampt，而在酵母中选择标记为尿喀晚缺陷型互补。
[0019] 本发明的第二个目的是一种提高丙酬酸产量和生产强度的方法，是在丙酬酸生产 菌株中过表达连接有序列如SEQIDNO. 1的信号肤的线粒体丙酬酸载体蛋白。
[0020] 在本发明的一种实施方式中，所述方法是表达NCBI上Gene10:852800的线粒体 丙酬酸载体蛋白MPC1。
[0021] 本发明的第Ξ个目的是提供所述重组菌在发酵生产丙酬酸方面的应用。
[0022] 在本发明的一种实施方式中，所述应用是将重组菌活化后接种至发酵培养基，在 30°C，220巧m条件下进行发酵培养。
[0023] 在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基1L中含有：葡萄糖120g，尿素 3.86g，Μ拆〇4. 7&0 0.8g，皿2口〇42邑，CHsCOONa3g，微量元素液10ml，维生素液10ml，初始抑 =5. 5 ;所述微量元素液：MnClz·4&0 12g，FeS〇4·7&0 2g，CaClz·2&0 2g，CuS〇4·5&0 0. 05g，化Cl2〇. 5g，用2mol/L的肥1溶解后定容至IL ;所述维生素液：生物素0. 004g，硫胺 素0. 75mg，化唉醇0. 04g，烟酸0.8g，用2mol/L的肥1溶解后定容至1L。
[0024] 在本发明的一种实施方式中，所述接种的接种量为10%。
[00巧]本发明还要求保护所述重组菌生产的丙酬酸在日化、食品、制备药物、农业领域的 应用。
[002引有益效果：
[0027] 本发明方法可提高丙酬酸产量和生产强度的；由于胞内高浓度的丙酬酸对 糖酵解途径中的关键酶存在反馈抑制作用，本发明通过定位表达线粒体丙酬酸载体蛋 白于细胞膜上，加强丙酬酸出细胞的速率，缓解丙酬酸的反馈抑制作用，来达到提高丙 酬酸发酵的生产强度和产量。相对于对照菌株灯排（ρΥ26))，本发明构建的重组菌株 Τ排（ρΥ26-化rewlp-MPCl)的细胞干重、葡萄糖消耗速率、丙酬酸的产量和丙酬酸生产强度 分别提高了 58. 3%、68. 1%、154. 4%和 152.6%。
【具体实施方式】
[0028] 菌株和质粒：光滑球拟酵母化gl油rataCCTCCM202019,T排）其为烟酸、生物 素、硫胺素、盐酸化唉醇，尿喀晚5种营养缺陷型菌株（即在T.gl油rataCCTCCM202019的 基础上敲除了化a基因），已进行保藏。酵母表达质粒ρΥ26为大肠杆菌-酵母之间的穿梭 载体，在大肠杆菌中选择标记为ampt，而在酵母中选择标记为尿喀晚缺陷型互补。
[0029] 细胞干重的测定：取一定量的菌悬液于10血容量瓶中，加入2血盐酸（2mol/L)溶 解悬液中的碳酸巧，加去离子水定容到1〇111以充分混匀，用UV7500型可见光分光光度计， 于660皿处测定0D值，利用细胞干重标准曲线计算出细胞干重。
[0030] 丙酬酸和葡萄糖的测定：高效液相色谱（HPLC)。仪器：Agilent1260高效液相色 谱仪（配紫外可见检测器、示差折光检测器和工作站），色谱条件：色谱柱：AminexHPX-87H ionexchangecolumn,流动相：5mMH2SO4,流速：0.6血/min,柱溫：40°C，进样量：10yL，紫 外检测器波长：210nm(检测丙酬酸），示差折光检测器：检测葡萄糖，样品制备：ImL发酵液 于12,000巧m下离屯、5mi