一种利用仿刺参加工液提取抗菌多肽的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及多肤的制备，尤其是一种利用仿刺参加工液提取抗菌多肤的方法。
【背景技术】
[0002] 我们知道，生物活性肤化iologically active peptide)是由20-60个天然氨基 酸W不同组成和排列方式构成的从二肤到复杂的线性、环形结构的不同肤类的总称，是源 于蛋白质的多功能化合物。活性肤具有多种人体代谢和生理调节功能，易消化吸收，有促进 免疫、激素调节、抗菌、抗病毒、降血压、降血脂等作用，食用安全性极高，是药物筛选、制备 疫苗和食品添加剂的天然资源宝库，也是当前国际食品界最热口的研究课题和极具发展前 景的功能因子。
[0003] 现有研究表明，肤的生物效价和营养价值比游离氨基酸更高，运也正是活性肤的 无穷魅力所在。在生物活性肤领域有一种抗菌多肤，运类活性多肤多数具有强碱性、热稳定 性W及广谱抗菌等特点。目前，所有的常规抗生素都出现了相应的抗药性致病株系，致病菌 的抗药性问题已经日益严重地威胁着人们的健康。寻找全新类型的抗生素是解决抗药性问 题的一条有效途径。抗菌多肤因为抗菌活性高，抗菌谱广，种类多，可供选择的范围广，祀菌 株不易产生抗性突变等原因，而被认为将会在医药工业上有着广阔的应用前景。
[0004]仿刺参（Apostichopus japonicas，Selenka)又称刺参，属棘皮动物口 (Echinodermata)，海参纲（Holothuroidea)，刺参科（Stichopodidae)，仿刺参属 (如osiicMws)。主要分布于西太平洋北部，包括中国黄勸海域、俄罗斯东部海岸、日本和 韩国沿岸等。而新鲜的仿刺参体内具有自溶酶，为利于保存，需要经过沸水煮制进行灭酶处 理，然后才可作为原材料保存或进行后续加工。然而仿刺参在煮制过程中，有许多营养成分 和功效成分会流失在加工液中。据前期研究发现，煮制100 kg仿刺参，至少会产生约60 kg 的加工液。目前，海参加工液没有充分利用直接排放，不仅会对周边水体造成富营养污染， 而且也是对资源的一种极大浪费。伴随着海参加工的规模化、集约化，可收集的海参加工 液资源越来越丰富，如何高值化利用该资源，变废为宝，开发成具有极高利用价值的功能食 品，延伸海参产业链，日渐成为海参加工企业和从事海参研究的科研人员共同关注的课题。 阳〇化]目前，还没有发现利用仿刺参加工液提取抗菌多肤的报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种工艺合理、操作可行、产物安全性高的利用仿刺参加工 液提取抗菌多肤的方法。
[0007] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种利用仿刺参加工液提取抗菌多 肤的方法，其特征在于：其经过下列工艺步骤： (1)原材料选取与处理 选取仿刺参加工液为原料，将其迅速冷却至4~10°C，管式离屯、，去除仿刺参加工液中 的不溶物，得上清液； (2) 脱盐 将步骤（1)中得到的上清液通过电渗析进行脱盐处理，得脱盐液； (3) 真空浓缩 将步骤（2)中得到的脱盐液进行真空浓缩至原溶液体积的1/10~1/20,得浓缩液； (4) 酶解 将步骤（3)中得到的浓缩液中加入2~5% (W底物蛋白含量计，W/V/D)海产品水解酶， 调整溶液抑值至7. 5~8. 5,溫度50~60°C，水解3~5h;水解后加热至90~100°C，保 持10~20min灭酶，得酶解液；将酶解液离屯、，得酶解上清液； (5) 浓缩、干燥 将步骤（4)中得到的酶解上清液进行真空浓缩至固形物含量在15~30%之间，冷冻干 燥，制得固体粉末； (6) 乙醇沉淀 将步骤（5)得到的固体粉末重新溶解于去离子水中，加入无水乙醇至乙醇终浓度为 70~90%，4°C沉淀1~化，离屯、去除多糖沉淀，得沉淀后的溶解液； (7) 超滤、冷冻干燥 将步骤（6)中得到的沉淀后的溶解液采用截留分子量为5000化的超滤膜进行超滤处 理，收集分子量小于5000Da的截留液，进行冷冻干燥，得到仿刺参加工液蛋白酶解产物； (8) 分离纯化 将步骤（7)中得到的仿刺参加工液蛋白酶解产物用去离子水溶解成浓度为0. 2~ 0.4g/Mj容液，采用Se地adexLH-20凝胶色谱柱进行分离纯化，其中，流动相为蒸馈水，洗 脱速度为0. 5~0. 8mL/min，220nm测定吸光度，收集各吸收峰洗脱液，备用； (9)抑菌活性测定、复合 将步骤（8)中得到的各吸收峰洗脱液进行抑菌活性测定；将测得具有抑菌活性的吸收 峰洗脱液合并，冷冻干燥，得复合抗菌多肤。
[0008] 所述的仿刺参加工液是新鲜仿刺参经解剖去肠后，放入沸水中煮10~30min，拱 出参体后所得液体。
[0009] 所述上清液的电渗析脱盐处理的电压控制为16~30V，流速控制为10~70LA。
[0010] 所述脱盐液的真空浓缩的条件为：真空度控制为82. 7~96KPa，溫度为50~ 60 °C。
[0011] 所述酶解浓缩液的海产品水解酶为南宁东恒华道生物科技有限公司生产的海产 品水解专用酶。
[0012] 所述酶解上清液的真空浓缩的条件为：真空度控制为82. 7~90. 6KPa，溫度为 45 ~55Γ。
[0013] 所述的各吸收峰洗脱液的抑菌活性测定是取100μΙE.coli菌液（ODe。。?为 0.3~0.5)涂布LB培养皿，设置3个重复；将步骤（8)中得到的各吸收峰洗脱液各取1-3μL 涂布在涂有菌液的培养皿上，同时设置卡那霉素（Kan+，10mg/mL)阳性对照组；测定具有抑 菌活性的吸收峰洗脱液。
[0014] 本发明W仿刺参加工加工液为原料，通过电渗透脱盐、真空干燥，得浓缩液；酶解 浓缩液，离屯、取酶解上清液，将酶解上清液真空浓缩、冷冻干燥后，得固体粉末；将固体粉末 复溶于去离子水，乙醇沉淀多糖，取沉淀后的溶解液采用凝胶过滤层析法，收集各吸收峰洗 脱液，洗脱液进行抑菌活性测后，将测得具有抑菌活性的吸收峰洗脱液合并，冷冻干燥，得 复合抗菌多肤。本发明采用了酶-膜禪联技术对仿刺参进行了深层次开发，具体体现在：1、 W电渗析脱盐的仿刺参加工液为酶解原料；2、采用凝胶色谱法从蛋白酶解产物中分离生物 活性肤；经抑菌活性测定，该复合多肤具有较好的体外抑菌活性。同时作为天然的抑菌多 肤，相比其他原核或真核表达产物，本发明所提取的抑菌多肤来源可靠，安全性高，后期研 究方便。本发明提供的提取抗菌多肤的方法工艺合理、操作可行、产物安全性高，同时减少 仿刺参加工液排放后的环境污染，具有广泛的社会和经济效益。
【附图说明】
[0015] 下面结合附图和实施例对本做进一步说明。
[0016] 图1是仿刺参加工废弃液蛋白酶解产物的Se地adexLH-20凝胶色谱分离图 (SephadexLH-20 洗脱曲线）； 图2多肤抑菌活性图； 图3是复合多肤组分高效液相分析图谱（检测波长214nm)。
【具体实施方式】
[0017] 下面结合附图和实施例对本做进一步说明。 阳〇1引实施例1 一种利用仿刺参加工液提取抗菌多肤的方法，其经过下列工艺步骤： (1) 原材料选取与处理 选取新鲜仿刺参经解剖去肠后，放入沸水中煮20min，拱出参体后所得仿刺参加工液为 原料，将其迅速冷却至6°C，管式屯、机控制转速6000r/min，离屯、20min，去除仿刺参加工液 中的不溶物，得上清液； (2) 脱盐 将步骤（1)中得到的上清液采用电驱动设备渗析脱盐，电压控制为24V，流速控制为 30LA，得脱盐液； (3) 真空浓缩 将步骤（2)中得到的脱盐液在真空度控制为86KPa，溫度为55°C条件下，浓缩至原溶液 体积的1/15,得浓缩液； (4) 酶解 将步骤（3)中得到的浓缩液中加入4%(W底物蛋白含量计，W/V/D)南宁东恒华道生物科 技有限公司生产的海产品水解酶，调整溶液抑值至8. 0,溫度55°C，水解4h;水解后加热 至95°C，保持15min灭酶，得酶解液；将酶解液离屯、，得酶解上清液； (5) 浓缩、干燥 将步骤（4)中得到的酶解上清液在真空度控制为85KPa，溫度为50°C条件下，浓缩至固 形物含量在20%之间，冷冻干燥，制得固体粉末； (6) 乙醇沉淀 将步骤（5)得到的固体粉末重新溶解于去离子水中，加入无水乙醇至乙醇终浓度为 80% (v/v)，4°C沉淀1.化，采用管式离屯、机控制转速4000r/min，离屯、15min,去除多糖沉 淀，得沉淀后的溶解液； (7) 超滤、冷冻干燥 将步骤（6)中得到的沉淀后的溶解液采用截留分子量为5000化的超滤膜进行超滤处 理，收集分子量小于5000Da的截留液，进行冷冻干燥，得到仿刺参加工液蛋白酶解产物； (8) 分离纯化 将步骤（7)中得到的仿刺参加工液蛋白酶解产物用去离子水溶解成浓度为0. 3g/mL溶 液，采用Se地adexLH-20(2. 0cmX60cm)凝胶色谱柱进行分离纯化，其中，流动相为蒸馈 7心洗脱速度为0. 6mL/min，220nm测定吸光度，收集各吸收峰洗脱液；如图1所示，本实施 例收集到5个吸收峰洗脱液； (9) 抑菌活性测定、复合 将步骤（8)中得到的各吸收峰洗脱液进行抑菌活性测定；其中，该抑菌活性测定是取 100μLE.coli菌液（ODe。。?为0. 3~0. 5)涂布LB培养皿，设置3个重复；将步骤（8)中 得到的5个吸收峰洗脱液各取2μL涂布在涂有菌液的培养皿上，同时设置卡那霉素（Kan+， 10mg/mL)阳性对照组；如图2所示，测得吸收峰洗脱液1、吸收峰洗脱液2具有较好的抑菌 活性，吸收峰洗脱液3~5无体外抑菌活性；将测得具有抑菌活性的测得吸收峰洗脱液1 和吸收峰洗脱液2合并，冷冻干燥，得复合抗菌多肤。
[0019] 高效液相色谱分析：将提得到的复合抗菌多肤进行高效液相色谱分析，其中，色谱 条件如下：色谱柱为反相C18键合硅胶柱（WatersAtlantis，T3,250mmX4.6mm，5μηι); 流动相：A水，B乙腊，梯度洗脱条件见下表1。流速：1. 0ml/min，柱溫30°C，检测波长为214 打m〇