凝血酶原时间测定试剂盒及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种体外诊断试剂盒及其制备方法，用于人血浆标本凝血酶原时间的 测定。更具体地，是一种利用组织因子醋化物制备的凝血酶原时间测定试剂盒及其制备方 法，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 医院临床实验室常规凝血实验，即凝血常规四项包括凝血酶原时间测定（PT)、部 分活化凝血活酶时间测定（APTT)、凝血酶时间测定（TT)、纤维蛋白原浓度测定（FIB)，主要 用于出血性疾病的筛查与诊断、血栓性疾病与血栓前状态检查、各种抗凝治疗监测W及手 术前检查。其中，PT为反应机体外源性凝血途径的主要检测指标，常用于：1血液凝固异常 可疑包括凝血酶原复合物多个因子（II、VII、X)，因子V，纤维蛋白原及去纤维蛋白原血症 的筛选实验；2监测及调整维生素K括抗剂，香豆素诱导剂的治疗；3监测维生素K缺乏及肝 脏疾病；4术前筛选可能的止血异常疾病。
[0003] 目前PT的临床检测多采用如ick法，其原理为在缺乏血小板的血浆内加入组织 促凝血酶原激酶（组织因子）和Ca2+后凝血酶原转变为凝血酶，通过产生的凝血酶使纤 维蛋白原转变为纤维蛋白。PT测定结果报告方式有Ξ种：秒值、根据标准曲线计算的百 分活度，国际标准化比率（internationalnormalizedratioINR)。PT测定结果受众多 因素的影响，其中凝血酶原试剂为最重要的影响因素。商品化的组织因子在敏感性上与 WK)推荐的有所不同，因此生产商需要对每批试剂确定一个敏感因子，此即国际敏感指数 ISI(internationalsensitivityindex)，它用来表示试剂中组织凝血活酶相对活性的指 数。不同来源的组织凝血活酶对凝血因子的敏感性不同，为了使不同敏感性的组织凝血活 酶在PT检测中得到同样的结果，必须要制定一个共同遵循的敏感指标。WHO先后制备或发 出了凝血活酶的多种国际参考品（IRP)，用已知ISI值的国际参考试剂与待测组织活酶试 剂检测同一标本，对结果进行比较分析，就可得出试剂的ISI数值。
[0004] 目前用于生产和出售的组织凝血活酶试剂必须标有ISI数值。PT测定影响因素很 多，其中最关键的是凝血酶原试剂，由于所用凝血酶原试剂的敏感度不同，即使在相同条件 下对同一标本测得的结果也不同，而我国医生常用的凝血酶原百分活动度则因为标准血浆 不统一而相差更大，甚至达到难W比较的程度。因此WK)于1981年提出PT标准化报告方 式为INR，INR= (PTR)ISI，其中ISI为国际敏感度指数，PTR为PT测定秒值（S)与PT标准 对照秒值（S)的比值。经上述公式换算成INR值后，能克服试剂之间敏感度差异的影响，使 INR值报告方式具有可比性和可信度。国内多数文献报告人工屯、脏瓣膜置换术后采用国际 正常标准化比值对口服抗凝药物治疗的监测，结果稳定、可靠，具有可比性。在口服抗凝药 治疗中，华法林类药物是非常有效的抗凝药物，它在不同病人体内的新陈代谢率不同，因而 它的剂量必须仔细监测，否则就会因超剂量而造成出血或因为剂量不足导致疾病复发，血 栓形成。由此可见在凝血酶原时间的测定中，准确的INR结果对临床抗凝治疗药物的监测 非常重要。但是不同ISI值的PT试剂测得的INR结果差异非常显著，而且当标本的INR值 越高时，测定结果差异越显著。理论上，ISI值越接近1. 0,表明试剂越敏感。 阳〇化]但是由于实验室使用PT试剂质量上的不同，使得同一个患者在不同医院测定的 结果相差悬殊，造成检测结果的不一致，影响对疾病的正确、及时诊断。因此，PT试剂的质 量成了获得准确结果及诊断的关键。同时，由于试剂复溶后的稳定性差，造成浪费，导致医 疗单位成本增加，患者负担加重，同时配制过程中的分装、冻干等步骤也会导致试剂间的差 异，从而造成检测结果的不准确，此外使用起来还需要复溶等步骤，造成操作过程的繁琐。 所W研制一种安全、可靠、准确、稳定，保存时间长、操作简便的PT试剂，对临床诊断疾病来 说是十分必要的。
【发明内容】
[0006] 为了克服上述现有【背景技术】中的不足，本发明提供一种凝血酶原时间测定试剂盒 及其制备方法，该凝血酶原时间测定试剂盒通过含有多种有效成分的缓冲液体系与组织因 子醋化物的结合，保证了试剂的稳定性，同时也免去了配制过程中的分装和冻干等步骤，得 到准确性、重复性及稳定性等总体性能更好且操作更简便的凝血酶原时间测定试剂。
[0007] 为了实现上述目的，本发明提供一种凝血酶原时间测定试剂盒，包括凝血酶原时 间测定试剂，所述凝血酶原时间测定试剂由缓冲液体系和溶解在所述缓冲液体系中的凝血 活酶组成，所述凝血活酶为组织因子醋化物，所述凝血活酶为组织因子醋化物，它在缓冲液 体系中的用量占缓冲液重量的0. 05~Iwt%;所述缓冲液体系各组分含量为：0. 05~3wt% 的牛血清白蛋白、6~20mM的氯化巧、20~200mM的缓冲剂、0. 05~0. 5wt%的叠氮化钢、 0. 05~Iwt%的氯化钢、其余为水，所述缓冲液体系的抑值为5. 0~8. 0,所述缓冲剂选自 于Tris-Hcl、MP0S、肥阳S、TRICI肥、TAPS0、PBS。
[0008] 优选地，在上述技术方案中，所述组织因子醋化物在缓冲液体系中的用量占缓冲 液重量的0. 15~0. 3wt%。
[0009] 优选地，在上述技术方案中，所述牛血清白蛋白在缓冲液体系中的含量为1~ 2wt%。
[0010] 优选地，在上述技术方案中，所述氯化巧在缓冲液体系中的含量为9~15mM。
[0011] 优选地，在上述技术方案中，所述缓冲剂在缓冲液体系中的含量为30~45mM。
[0012] 优选地，在上述技术方案中，所述叠氮化钢在缓冲液体系中的含量为0. 1~ 0. 15wt%。
[0013] 优选地，在上述技术方案中，所述氯化钢在缓冲液体系中的含量为0. 1~ 0. 3wt%。
[0014] 优选地，在上述技术方案中，所述缓冲剂为MP0S、PBS体积比为1:2. 5的混合物。
[0015] 本发明还提供一种制备上述凝血酶原时间测定试剂盒的方法，包括如下步骤：（1) 按照不同配比配制缓冲液体系，将抑调至5. 0~8. 0,加入组织因子醋化物，揽拌混匀后得 到初始的凝血酶原时间测定试剂；（2)将初始试剂在血凝仪上进行质控的测定，将质控测 定结果调至符合该机型血凝仪配套质控说明书要求的范围，测定结果最接近质控平均值的 试剂配方确定为相应机型最终的试剂配比；（3)W最终的试剂配比，按照步骤（1)的配制方 法即得凝血酶原时间测定试剂盒。
[0016] 本发明的有益效果：提供一种凝血酶原时间测定试剂盒及其制备方法，该凝血酶 原时间测定试剂盒免去了配制过程中的分装和冻干等步骤，避免了因冻干和复溶过程造成 的试剂的瓶间差异，从而导致测定结果之间的较大差异。本发明试剂无需冻干，即可保证试 剂的稳定性，确保了开瓶后试剂的最优有效性持续至少一个月，避免了实验结果间的较大 差异，同时节约了试剂的用量，开瓶即用，操作起来更加快捷简便。
【具体实施方式】
[0017]W下结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述。
[0018] 本发明的凝血酶原时间测定试剂盒，包括凝血酶原时间测定试剂，凝血酶原时间 测定试剂由缓冲液体系和溶解在缓冲液体系中的凝血活酶组成，凝血活酶为组织因子醋化 物，它在缓冲液体系中的用量占缓冲液重量的0. 05~Iwt% ;缓冲液体系各组分含量为： 0. 05~3wt%的牛血清白蛋白、6~20mM的氯化巧、20~200mM的缓冲剂、0. 05~0. 5wt% 的叠氮化钢、0. 05~Iwt%的氯化钢、其余为水，缓冲液体系的抑值为5. 0~8. 0,缓冲剂选 自于Tris-Hcl、MP0S、肥阳S、TRICI肥、TAPS0、PBS。使用本发明试剂盒时，待测血浆与凝血 酶原时间测定试剂用量的体积比为1:1. 9~2. 2。
[0019] 制备上述凝血酶原时间测定试剂盒的方法，包括如下步骤：（1)按照不同配比配 制缓冲液体系，将抑调至5. 0~8. 0,加入组织因子醋化物，揽拌混匀后得到初始的凝血酶 原时间测定试剂；（2)将初始试剂在血凝仪上进行质控的测定，将质控测定结果调至符合 该机型血凝仪配套质控说明书要求的范围，测定结果最接近质控平均值的试剂配方确定为 相应机型最终的试剂配比；（3)W最终的试剂配比，按照步骤（1)的配制方法即得凝血酶原 时间测定试剂盒。 阳〇2〇] 实施例1
[0021] 凝血酶原时间测定试剂盒，包括凝血酶原时间测定试剂，凝血酶原时间测定试剂 由缓冲液体系和溶解在所述缓冲液体系中的凝血活酶组成，凝血活酶为组织因子醋化物， 组织因子醋化物在缓冲液体系中的用量占缓冲液重量的0. 05wt% ;缓冲液体系各组分含量 为：3wt%的牛血清白蛋白、20mM的氯化巧、20mM的肥阳S、0. 5wt%的叠氮化钢、0. 05wt%的 氯化钢、其余为水，缓冲液体系的抑值为7. 0。