一种检测结核分枝杆菌及其耐药基因突变的试剂盒及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及结核分枝杆菌及其耐药基因突变检测领域，具体涉及一种检测结核分 枝杆菌及其耐药基因突变的试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002] 结核病是由结核分枝杆菌（结核菌）感染所导致的疾病。自20世纪后期开始，结 核病发病率逐渐上升，至今仍然是单一感染因素引起死亡人数最多的疾病之一。根据世界 卫生组织（World化alth化ganization,WHO) 2012年的最新统计报告，全球将近Η分之一 的人口曾经或者现在感染结核分枝杆菌。2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查结果 显示，我国仍然是结核病高负担国家，虽然结核病发病率较上次调查呈现下降趋势，但又出 现了新的问题。由于结核菌生长缓慢，临床结核病的诊断和耐药分析一直是一个难题，造成 对结核病患者的不规范治疗现象，引起结核分枝杆菌的耐药性不断提高，严重影响患者的 治疗效果。
[0003] 在引起的临床结核病的致病菌中，除了结核分枝杆菌外，还有一部分非结核分枝 杆菌（ΝΤΜ，指分枝杆菌属中除了结核分枝杆菌外的其他分枝杆菌菌种）感染率已经占所有 分枝杆菌感染的11. 1 %。ΝΤΜ所致疾病的临床表现、X线特征和姨涂片与结核分枝杆菌导 致的结核病极其相似，但治疗方式却不同，大多数非结核分枝杆菌（ΝΤΜ)对临床抗结核药 物呈天然的抗药性，治疗方案相差较大，因此与结核分枝杆菌结核病的鉴别诊断显得尤为 重要。所W运用分子诊断手段检测结核分枝杆菌的同时，需要对引起疾病极为相似的非结 核分枝杆菌进行鉴别诊断。所述引起结核病的常见非结核分枝杆菌包括鸟分枝杆菌、胞内 分枝杆菌、偶然分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌等。
[0004] 随着科学技术的逐渐发展，结核病的的耐药机制及分子基础正被慢慢解开，目前 的研究发现结核菌发生耐药的原因是抗结核药物作用相关基因发生突变导致抗结核药物 与药物作用结合位点亲和力下降所致。越来越多的研究者试图利用各种快捷方法进行结核 病耐药检测。目前耐药结核病的诊断方法种类繁多，主要可W分为表型检测和基因检测两 个方面。表型检测方法主要有结核分枝杆菌药敏试验、快速检查耐药突变显微镜观察法、 瞻菌体药敏法、流式细胞术药敏试验，但送些种方法均存在较大局限性，远不能满足临床需 求。因此结核菌的耐药研究方向逐渐转向基因检测。在临床上，五种一线抗结核药物中利福 平（RFP)\异烟阱（ΙΝΗ)是主要药物，是国家推荐联合化疗方案的基石，但临床上已经出现 严重的对利福平和异烟阱耐药的结核分枝杆菌结核病。其中利福平耐药机制比较明确，其 是由于rpoB基因发生突变引起所编码RNA多聚酶目亚单位变异而导致利福平无法与RNA 聚合酶结合引起耐药的。现已证明90%~95%的利福平耐药结核分枝杆菌存在rpoB基因 突变，且集中于8化P核必区。因此，通过对该区域基因序列的突变检测可W获得对利福平 的耐药信息。
[0005] 耐药结核病基因检测主要方法有聚合酶链反应-单链构象多态性分析 (PCR-SSCP)、限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP)、双脱氧指纹图法（ddF)、直接测序法 w及基因芯片法等，但送些方法都由于操作繁琐、成本较高、技术复杂或者效率较低等缺 陷，未能在临床上大范围普及使用。
[0006]出于送种考虑，本发明的发明人进行了研究，目的是解决相关领域现有技术所暴 露出来的问题，期望提供一种耗时短、易操作、高通量、成本低的检测结核分枝杆菌及其耐 药基因突变的试剂盒及其应用
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种检测结核分枝杆菌及其耐药基因突变的试剂盒，其具有 低成本、易操作、耗时短、灵敏度高、特异性好等突出技术效果，可广泛应用于临床检测。
[0008] 本发明的目的是通过如下技术方案来实现的：
[0009]本发明提供一种检测结核分枝杆菌及其耐药基因突变的试剂盒，其包括PCR反 应试剂、固相支持物、含有碱性磯酸酶标记链霉亲和素的杂交液W及显色试剂；其中，所述 PCR反应试剂包括用于扩增祀核酸的生物素标记的引物，所述固相支持物的表面固定有用 于检测结核分枝杆菌及其耐药基因突变的核酸探针。
[0010] 本发明的试剂盒直接将碱性磯酸酶标记链霉亲和素加入到杂交液中，可W在核酸 探针与祀核酸杂交的过程中同步实现碱性磯酸酶标记链霉亲和素与生物素的结合过程，从 而可W在固相支持物表面形成碱性磯酸酶标记核酸杂交体的偶联物，省去了传统反向分子 杂交技术中在杂交反应后需要单独进行酶联反应的步骤W及其他多个操作步骤，极大缩短 了传统方法检测祀核酸的耗时。
[0011] 在本发明的试剂盒中，所述碱性磯酸酶是一种同源二聚体蛋白，是一种含锋的金 属酶。每分子酶至少含2个化原子。酶上包含3种类型的金属结合位点，即所谓的催化结 合位点、结构结合位点和调节结合位点。其中两个催化结合位点的结合则只会导致一个亚 单位的磯酸化，即负协作亚单位之间发生相互作用。
[0012] 在本发明的试剂盒中，所述生物素有两个环状结构I和II。其中，I环为咪哇丽 环，是其与链霉亲和素结合的主要部位；II环为喔吩环，C2上有一戊酸侧链；生物素分子通 过其末端的駿基与本发明所述的祀核酸连接，从而标记在祀核酸分子上。
[0013] 在本发明的试剂盒中，所述链霉亲和素是由链霉菌分泌的一种蛋白质，其分子由4 条相同的肤链组成，每条肤链都能结合一个生物素，因此每个链霉亲和素分子能结合4个 生物素分子。此外，每条肤链的氨基酸组成中，甘氨酸和丙氨酸的含量较大，肤链中的色氨 酸残基是连接生物素的活性基团。所述链霉亲和素与生物素二者亲和结合的常数（K)为 10巧L/mol。在本发明的方法中，祀核酸与核酸探针杂交的同时，链霉亲和素与生物素也进 行亲和结合，因此杂交液中的碱性磯酸酶标记链霉亲和素分子与固定在固相支持物表面的 核酸探针分子在一步反应中竞争性结合生物素标记的祀核酸分子。
[0014] 本发明的发明人经过大量实验与创造性劳动发现，在本发明的方法中，将所述碱 性磯酸酶标记链霉亲和素直接加入到杂交液中，一方面能够使得碱性磯酸酶标记链霉亲和 素与生物素标记祀核酸充分的结合；另一方面还能够促进核酸杂交效率，缩短核酸杂交反 应的时间。
[0015] 根据本发明的一个具体实施例，所述碱性磯酸酶标记链霉亲和素在杂交液中的浓 度为0. 05~2μg/ml，优选0. 1~1. 5μg/ml，更优选0. 5~1. 2μg/ml。在本发明的方法中， 可W列举的所述碱性磯酸酶标记链霉亲和素在杂交液中的浓度包括但不限于；〇. 05μg/ml、0.06μg/ml、0. 07μg/ml、0. 08μg/ml、0. 09μg/ml、0. 1μg/ml、0. 2μg/ml、0. 3μg/ml、 0. 4μg/ml、0. 5μg/ml、0. 6μg/ml、0. 7μg/ml、0. 8μg/ml、0. 9μg/ml、1μg/ml、1. 1μg/ml 矛口 1. 2μ邑/ml。
[0016] 在本发明的试剂盒中，所述碱性磯酸酶标记链霉亲和素在杂交液中的浓度是本发 明的重要方面。本发明的发明人经过大量试验与创造性劳动发现，如果碱性磯酸酶标记链 霉亲和素在杂交液中的浓度过低，郝么影响祀核酸检测的灵敏度；如果碱性磯酸酶标记链 霉亲和素在杂交液中的浓度过高，郝么容易带来非特异性吸附现象，影响祀DNA检测结果 的准确性。
[0017] 根据本发明的一个具体实施例，所述杂交液包括锋离子、镇离子、蛋白、非离子型 表面活性剂和阳离子型聚合物；其中，所述蛋白选自白蛋白、酪蛋白和明胶，所述非离子型 表面活性剂选自吐温和曲拉通，所述阳离子型聚合物选自阳离子聚丙帰醜胺、多聚赖氨酸 和聚合氯化铅。
[0018] 根据本发明的一个具体实施例，在所述杂交液中，锋离子为0. 001~0. 1111〇1/1，镇 离子为0.001~0.1111〇1/1，蛋白占杂交液的0. 1%~10% (w/v)，非离子型表面活性剂占杂 交液的0. 01~2% (v/v)，阳离子型聚合物占杂交液的0. 01~0. 5% (w/v);优选地，锋离 子为0. 005~0. 05mol/l，镇离子为0. 005~0. 05mol/l，蛋白占杂交液的1 %~5 % (w/v)， 非离子型表面活性剂占杂交液的0. 05~1 % (v/v)，阳离子型聚合物占杂交液的0. 05~ 0. 2% (w/v)〇
[0019] 根据本发明的一个具体实施例，所述锋离子可W选自含锋离子的可溶性盐。可用 作本发明的所述含锋离子的可溶性盐的实例包括：硫酸锋、氯化锋W及其他各种在溶液状 态可W解离出锋离子的盐。
[0020] 根据本发明的一个具体实施例，所述镇离子可W选自含镇离子的可溶性盐。可用 作本发明的所述含镇离子的可溶性盐的实例包括：硫酸镇、己酸镇、氯化镇W及其他各种在 溶液状态可W解离出镇离子的盐。
[0021]根据本发明的一个具体实施例，所述吐温选自吐温20灯ween-20)、吐温 21(Tween-21)、吐温 40(Tween-40)、吐温 60(Tween-60)、吐温 61(Tween-61)、吐温 80灯ween-80)、吐温81OVeen-Sl)和吐温85灯ween-85)，其中吐温20是特别优选的。 [002引根据本发明的一个具体实施例，所述曲拉通选自曲拉通X-100(TritonX-100)、曲 拉通X-114灯ritonX-114)和曲拉通X-200灯ritonX-200)，其中，曲拉通X-100是特别优 选的。
[0023] 在本发明的试剂盒中，本发明的发明人经过大量实验与创造性劳动发现，酸、碱、 盐离子或温度条件的变化都可能会改变甚至使碱性磯酸酶完全失去活性，因此为了实现本 发明的目的，杂交液成分的选择是极为重要的。在本发明的试剂盒中，发明人通过在杂交液 中添加锋离子、镇离子、蛋白和非离子型表面活性剂，一方面有助于提高核酸杂交效率，另 一方面防止杂交液中的碱性磯酸酶标记链霉亲和素因吸附而变性，再一方面防止碱性磯酸 酶标记链霉亲和素分子之间因相互作用而导致的聚合变性。
[0024]在本发明的试剂盒中，所述蛋白分子与非离子表面活性剂在杂交液中还能够进一 步发生协同效应，共同通过范德华力结合到固相支持物的表面，有效防止未反应的碱性磯 酸酶标记链霉亲和素和/或生物素标记祀标核酸在固相支持物表面的非特异性吸附，起到 很好的封闭作用，从而使本发明的方法可W省去杂交反应前的预杂交步骤。
[00巧]在本发明的试剂盒中，所述阳离子型聚合物能够与生物素标记的祀核酸分子（通 过PCR扩增获得的生物素标记祀核酸分子）产生静电吸附作用，使单链核酸分子（带许多 负电荷）带上一个正电荷部分，从而在核酸分子杂交过程中同步吸附到固相支持物的表 面。由于碱性磯酸酶标记链霉亲和素也带有正电荷，送样就避免了碱性磯酸酶非特异性吸 附到固相支持物的表面。此外，所述阳离子型聚合物可W使得碱性磯酸酶标记链霉亲和素 在杂交液中形成均匀悬液，使得杂交反应完成W后标记在核酸偶联物上的碱性磯酸酶保持 活性状态，从而使得碱性磯酸酶构象的平衡转换朝着天然状态移动。
[0026] 在本发明的试剂盒中，所述杂交液中还可W包括杂交促进剂，所述杂交促进剂在 本质上是本领域技术人员所已知的，可作为本发明所述杂交促进剂的实例包括但不限于： 硫酸葡聚糖、聚己二醇、酪或硫氯酸脈。
[0027] 在本发明的试剂盒中，所述杂交液中还可W包括其他成分，可W列举的杂交液中 其他成分的实例包括但不限于；氯化钢、杂交缓冲溶液、Denhar化'S溶液、十二烷基肌氨 酸钢或十二烷基礙酸钢。可W用于本发明所述杂交缓冲溶液的实例包括但不限于：巧樣 酸-巧樣酸钢缓冲溶液或Tris-盐酸缓冲溶液。
[0028] 在本发明的试剂盒中，所述杂交液不包括己二胺