尿液中exosome源性miRNAs生物标记物的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分离、制备或纯化DNA或RNA的方法领域，具体是一种尿液中exosome的miRNAs生物标记物的检测方法。
【背景技术】
[0002]exosome是细胞内多囊泡体(multivesicular bodies, MVBs)的腔内囊泡，被大量释放于生物体液中，例如血液、尿液、脑脊液、恶性胸腹水、羊水及滑液等体液。在MVBs与细胞膜融合之后以胞吐的方式释放入细胞外环境中，直径为30?150 nm。exosome含有多种蛋白质、mRNAs及miRNAs，exosome能够携带RNA分子循环于血液中进行长距离的细胞间通讯。
[0003]目前，以无创性方法收集的常见生物体液是血清与血浆，其中循环miRNAs近年来备受关注。与mRNAs相比较，循环miRNAs比较稳定，能耐受储存与冻融循环，减少物理降解，同时也能抵抗血清中核糖核酸酶(RNAse)及体外RNAse A等生物化学降解。在富于RNAse的血液环境中，许多机制保护循环miRNAs，其中exosome被认为是一种主要的保护机制。exosome的外膜对RNA提供了全面的保护，将其与易于消化的细胞外环境隔绝。
[0004]以无创性方法收集的另一种常见生物体液是尿液，尿液不仅容易获得，而且收集简便、无创、数量大。存在于尿液中的miRNAs与循环miRNAs的保护机制大致相同，但由于尿液成分复杂，而且泌尿系统中存在大量的RNAse活性，使得尿液中的裸miRNAs更易于降解，因此研究源于exosome的miRNAs更具有现实意义。
【发明内容】
[0005]本发明就是为了提供一种来源于尿液的exosome的制备方法以及从中提取和鉴定其所包含的miRNAs生物标记物的方法，所提出的一种尿液中exosome源性miRNAs生物标记物的检测方法。
[0006]本发明是按照以下技术方案实现的。
[0007]—种尿液中exosome的miRNAs生物标记物的检测方法，包括以下步骤:
a.exosome的制备
收集尿液，按照体积比为尿液:蛋白酶抑制剂混合物=50:4.22的比例加入蛋白酶抑制剂混合物；1-4° C，1800-2200g条件下离心去除细胞沉淀及膜碎片；取上清，1-4° C，15000-17000g条件下离心去除大直径多囊泡体；取上清，1-4° C，150000-200000g条件下离心收集沉淀；用无RNAse水重悬沉淀，再次在1-4° C，150000-200000g条件下离心收集沉淀，即得exosome ；
b.total RNA提取及纯化
按照体积比为尿液量:TRIzol LS溶液=100:1的比例，向步骤a获得的沉淀中加入TRIZ0L LS溶液，混匀；并按照体积比为TRIZOL LS溶液:氯仿=5:1的比例，加入氯仿，离心；吸取上层水相并加入异丙醇，静置过夜，离心；用75%乙醇洗涤沉淀后，离心收集沉淀，干燥，用无RNAse水重悬RNA沉淀；真空冷冻干燥仪纯化上述溶解后total RNA ;
c.合成miRNAcDNA第一链
①miRNA3’末端加Poly(A)反应；
②Poly(A)修饰的miRNA逆转录反应；
d.荧光定量qPCR反应
将步骤 c ②中获得的 miRNA 第一链 cDNA 进行 hsa-miR-15b_3P，hsa-miR-15a_3P 及hsa-miR-135b-5P的荧光定量检测。
[0008]本发明获得了如下的有益效果:本发明提供了一种来源于尿液的exosome的制备方法以及鉴定其中所包含的miRNAs生物标记物的方法。与从血清与血楽中提取exosome并进一步富集miRNAs的方法相比，本发明所使用的生物体液更容易获得，收集简便、无创、数量大。不仅如此，尿液中存在着大量的exosome，而且exosome的外膜对其中的miRNAs具有很好的保护作用。本发明获得了来源于尿液的exosome及其中miRNAs的种类，具有广阔的应用前景。
【附图说明】
[0009]图1是本发明透射电镜下exosome形态及大小图；
图2是本发明NanoSight LM10检测exosome大小分析图；
图3是本发明Western Blot检测exosome标记蛋白TSG101和CD9的鉴定图；
图 4 是本发明 RT-qPCR 进行 hsa-miR-15b_3P，hsa-miR-15a_3P 及 hsa-miR-135b_5P 检测后平均CT值分析图。
【具体实施方式】
[0010]下面结合附图及实施例对本发明做进一步详细的说明。
[0011]1.exosome的制备:留取清晨中段尿液200ml，每50ml尿液加入蛋白酶抑制剂混合物(包括 1.67ml 的 lOOmM NaN3, 2.5ml 的 10mM PMSF，50ul 的 ImM Leup印tin);4° C，2000g离心10分钟，去除细胞沉淀及膜碎片；取上清4° C，17000g离心45分钟，去除大直径多囊泡体；取上清 4。C，200000g (BECKMAN COULTER、L-100 XP Ultracentrifuge)离心 65分钟；去除上清，无RNAse水重悬沉淀；4° C，200000g再次离心65分钟，所得沉淀即为exosome ；
每50ml尿液所得沉淀根据进一步实验目的，用相同体积的不同溶液溶解，用于电镜观察的用30ul无水乙醇溶解，用于Western Blot及NanoSight LM10检测的用30ul PBS溶液溶解，exosome溶解液于_80°C保存备用。
[0012]2.Exosome的电镜观察及NanoSight LM10分析:用无水乙醇溶解exosome沉淀，超声波分散exosome悬浮液5分钟，将少许悬浮液滴于超薄碳膜铜网上，充分瞭干，1%。磷鹤酸负染，充分瞭干，透射电镜观察、拍照。如图1所不，exosomes的负染电镜照片显不尿液来源的exosomes小体为扁平或球形小体，直径约为50nm左右(图1中箭头处所示)；如图2所示，NanoSight LM10分析显示本发明尿液中的exosome大小在30nm?500nm范围之内，但是主要集中于140nm处。
[0013]3.Exosome 的 Western Blot 检测:用 30ul PBS 溶解 exosome 沉淀，BCA 法测定exosome蛋白浓度；计算蛋白浓度，加入非还原性5X SDS上样缓冲液，95° C变性5分钟；配制5%浓缩胶与12%分离胶；将变性后混合物上样，电泳(浓缩胶时电压为80V，分离胶时电压为150V左右)；应用0.22um PVDF膜进行电转，100V 1小时；5%牛奶封闭10分钟；一抗⑶9稀释1500倍，TSG101稀释2000倍，室温孵育90分钟；通用二抗(辣根酶标记山羊抗兔或鼠IgG)稀释5000倍，室温孵育45分钟；显影，拍照(显影液即用即配)。如图3所示，Western Blot检测同一例样本exosome中标记蛋白TSG101和0)9均表达，且TSG101表达尚于⑶9的表达。
[0014]4.包含miRNAs的total RNA的提取及纯化:100ml尿液超速离心所得exosome沉淀加入1ml TRIzol L