采用兼并引物复合扩增21个短串联重复序列的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，设及检测人类基因组中具有多态性的遗传标记基因。 本发明设及用聚合酶链式反应在一个扩增体系中同时扩增多个短串联重复基因座。运用兼 并引物的方法改进和提高引物序列在人类单核巧酸多态性（SN巧位点的扩增效率，有效避 免由于SNP引起的座位丢失或分型错误的现象。
【背景技术】
[0002] 短串联重复序列（简称STR)也称为微卫星或简单序列重复（SSR)，是一类广泛存 在于真核生物基因组中的DNA串联重复序列，核屯、序列为2-6个碱基重复单位。STR基因 座数量大，分部广泛，约占整个基因组的3%(InternationalHumanGenomeSequencing Consortium, 2001)，而且多态性高，其多态性主要源自核屯、序列重复次数在个体间的差异， 并且运种差异在遗传过程中遵循孟德尔遗传规律。因此，STR扩增检测技术被广泛用于个 体识别、亲缘鉴定和群体遗传学研究。
[0003] 目前STR复合扩增技术为法医个体识别和亲子鉴定的主要技术手段，在世界各地 的DNA实验室得到广泛应用（《化'6113；[。DNATyping》secondedition,JohnButler)。 在案件分析中得到广泛应用，为案件侦破提供有力证据。随着发展，很多国家利用运一技术 建立犯罪分子及嫌疑人的DNA数据库，也就是对在押犯人和犯罪嫌疑人的DNA数据分析并 录入到数据库中，便于进行比对和排查等工作。
[0004] 早期的STR复合扩增技术能够实现在一个反应体系中扩增10个左右的STR基因 座，随着应用的广泛和数据比对的增加，10个基因座提供的信息不能满足要求，国内外的厂 家开发出新的更多基因座的产品，比如美国ABI公司的AmpFlSTRIdentifier试剂盒和美 国Promega公司的Power針微液16试剂盒都是15个STR基因座加性别决定基因。国内也 有类似的产品，比如公安部二所的DNATyperl5能够同时实现15个基因座扩增值NATyperlS 基因座的研究与选择，叶健等，《刑事技术》，2007年03)。
[0005] 但是，近年来随着DNA作为鉴定手段的应用越来越广，用户对试剂盒的基因座数 量、信息含量和扩增时间有了更高的要求。在DNA数据库建设方面，对于试剂盒兼容性也提 出了新的要求。我国的目前DNA数据库中有200万份左右，我国将在DNA数据库建设方面 进一步加速，到2013年DNA数据库中的数据将超过1000万份，英国等发达国家的数据库中 约有占总人口 10% 的数据化ttp://www.forensic,gov.址,Asplen, 2004)。随着我国DNA 数据库建设规模将不断扩大，数据比对的作用越来越重要。数据比对是建立在STR复合扩 增分析得到的数据基础之上，需要各个STR试剂盒在基因座位上具有兼容性（中国法庭科 学DNA数据库，《中国法医学杂志》，姜先华，2006年第12卷第5期）。
[0006] 目前所采用的试剂盒大多W美国的C0DIS标准规定的13个核屯、基因座（vWA、 D21Sll、D18S51、D5S818、D7S820、D13S317、D16S539、FGA、D8S1179、D3S1358、CSFlPO、?〇l、 ΤΡΟ讶为基础，在此基础只是选择增加其他基因座，还有部分产品删除了13个核屯、序列中 的部分基因座。但是随着用户对试剂盒的基因座数量、信息含量和兼容性的的更高需求，各 厂商推出了具有更多位点且符合最新CODIS位点的试剂盒。各厂商试剂盒基因座信息见表 1。所W，如果采用不同生产商的STR试剂盒，导入到DNA数据库中的数据是有基因座差异 的。运样在比对的时候，不是所有数据都有效，只是相同基因座部分的数据可W比对，而不 同的部分就无法应用。例如，Identifiler试剂盒和PowerPlex?' 16试剂盒之间相同STR基 因座为13个，其他两个STR基因座由于不同所W在数据比对时没有作用。并且，运13个可 比对基因座数据用于排除的时候是可靠的，但是用于认定的情况下往往是不够的。需要更 多的基因座数据。所W，由于各STR试剂盒基因座不同，导致了DNA数据库部分数据资源浪 费，并且有效性不够。因此，目前不同生产厂商开发出可W同时得到更多基因座位的产品， W增加自身产品的兼容性。理论上，STR检测试剂盒包含座位数越多，对于DNA数据库建设 越有利，获得的DNA身份数据有效性就越高。鉴于目前WPCR扩增和毛细电泳分离不同巧 光片段为技术基础的STR身份鉴定试剂盒大多W20-24个基因座位为主（表1)，少数产品 达到25-26个基因座位。另一方面，在一定大小的片段内基因座位越多，不同等位基因的排 列则比较拥挤，在大量人群数据库数据收集过程中，不同的或者稀有的等位基因型出现会 造成相邻等位基因的交错，引起分型错误。最后，得到的有效基因型数据会少于产品规定的 基因座数目。因此，在目前应用最为广泛的试剂盒仍W20个左右基因座位为主。近年来， 新兴的高通量测序技术应用于STR身份鉴定可W收集更多的基因座位信息，身份识别位点 达到200个，其中包括染色体基因座位位点数目可达69个。由于目前此技术成本较高，操 作复杂限制了其实际应用，身份鉴定仍W现在常用的技术为主。
[0007] 随着STR检测试剂盒在实际应用中，特别是在DNA身份鉴定数据库建设中试剂盒 对于样品的适应性要求不断提高，即可W直接扩增不同样品材料（比如：血滤纸片、唾液卡 片、FTA卡等材料），而不必对材料进行预处理，使用更加方便。另外，要求尽量缩短扩增的 时间。传统的试剂盒扩增时间在3至4小时左右，本公司上一代Golden巧e20A试剂盒扩 增时间也在2. 5小时左右。如果能实现1. 5小时内完成一次扩增反应，也是试剂盒性能提 升的表现之一〇
[0008]因此，DNA鉴定领域需要具有一个反应扩增较多的基因座、提供较多的信息、具有 更好兼容性和更快扩增速度的STR复合扩增体。能够在一小时30分钟内实现一次反应扩 增21个有效的基因座，满足数据库建设和其它身份鉴定需求。
[0009] 表1:各主流生产商试剂盒的基因座位信息
[0010]
[0011] 注：黑色字体表示CODIS13个基因座位，+表示被包括的基因座，一表示不包括的 基因座
[0012] 人类基因组序列中除含有串状重复序列的多态性外，还存在广泛单核巧酸多态 性（SNP)。有报道在人类编码区平均220-35化P出现1个SNP，而在人类全基因组中平均 lOOObp则出现一个SNP。SNP也具有良好的多态性和稳定的遗传性，因此继限制性片段多态 性（RFL巧和短串联重复（STR)作为遗传标记后，SNP已发展成为新一代的遗传标记手段。 多个STR基因座复合扩增身份鉴定试剂盒，是基于PCR扩增技术设计制备。因此，引物序列 的选择不可避免会遇到SNP位点。有些SNP位点发生率比较稀少且发生比率未知，但在人 类身份鉴定DNA数据库的建设过程中，样品数量很大，因此出现的可能性也增加。因此SNP 需要在STR身份鉴定试剂盒的设计开发中不可忽视。引物序列设计的原则是尽量避开SNP 位点，或者是尽量避免SNP位点出现在靠近引物的3'末端。因为3'末端的碱基不匹配会 严重降低PCR的扩增成功率，造成位点片段信号降低甚至缺失，从而引起分型错误。通过 GeneBanK的SNP数据库的查询发现在专利CN101818192A和CN103820559A公开的引物序列 中SNP位点（表2和表3)。性别识别位点一引物在3'端最末一个碱基在扩增发生SNP突 变的某些样品很容易扩增失败，造成运一位点缺失。因此，本发明按照上述原则进行引物设 计，尽量避免在SNP位点靠近引物序列的3'末端。对于引物序列中不可避免的SNP位点采 用设计兼并引物的方法，防止引物遇到SNP序列时碱基不匹配引起的扩增失败。
[001引 表2CN103820559A中引物序列中含有的SNP位点
[0014]
【发明内容】
[0017] 本发明是针对上述现有技术的缺陷，建立了一次检测21个STR基因座的复合扩增 体系，运些STR基因座包含了目前国内外各个生产商所采用的常用基因座位。
[0018]所述的基因座为Amelogenin(AMEL)、vWA、D21S11、D18S51、D5S818、D7S820、 D13S317、D16S539、FGA、D2S1338、D19S433、D6S1043、D12S391、D8S1179、D3S1358、D1S1656、 CSFIPO、化nta D、化nta Ε、??01、ΤΡ0Χ。
[0019] 本发明的扩增体系包含引物混合物、反应缓冲液和热启动DM耐热聚合酶等。
[0020] 首先针对上述21个基因座在其重复序列的侧翼分别设计特异性引物。引物设计 采用Primer5软件，每条引物退火溫度接近或高于60°C。不能产生引物二聚体、其它相互 作用或交叉反应，扩增产物长度在90-450bp之间。对每对引物进行扩增测试并优化，直至 得到清晰单一扩增条带。引物序列见下表4。
[0021] 表4 :复合扩增体系各基因座引物序列
[0022]
[0023] 根据扩增片段长度等将上述基因座分为4组：第一组包含D19S433、TW1、D21S11、 D18S51和化ntaE，第二组包含D3S13