肺癌alk基因重排快速检测荧光探针及制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体设及肺癌相关基因快速检测技术领域。
【背景技术】
[0002] 随着现代医学的发展W及治疗理念的更新，肿瘤的治疗已经由传统的手术W 及放化疗逐渐向个性化的分子祀向治疗转变，而寻找一个特异并且有效的治疗祀点，是 当前肿瘤治疗研究的热点之一。棘皮动物微管相关样蛋白4(Echinode;rmmicrotubule associatedprotein-like4,EML4)与问变性淋己瘤激酶（AnaplasticLymphomaKinase, ALK)融合基因是非小细胞肺癌（NSCLC)中继表皮生长因子受体巧GFR)突变、Kras(ras基 因家族中一种）突变后的又一特异性肿瘤驱动基因的分子祀向位点。EML4和ALK基因均 定位于2号染色体的短臂，分别位于P21带和P23带，由于两者的分布方向相反，故在发生 融合时，其中一者需要从染色体上断裂，从而调转方向，与另一者发生融合。由于EML4断裂 位点的多变，所W与ALK发生融合可W形成多种不同的亚型。目前已经发现的EML4-ALK融 合基因亚型至少有11种，其中部分亚型与肿瘤的发生密切相关。运些融合位点包括EML4 编码蛋白质N端的基因片段和ALK编码蛋白质C端激酶结构域的基因片段。新融合基因的 蛋白产物能够持续激活ALK激酶，激活下游信号通路，促进肿瘤细胞的增殖、分化、抗调亡。 到目前为止除EML4基因外，已知还有TGF、KIF5B等多种基因可与ALK基因发生融合，启动 ALK基因的表达，从而驱动致癌。祀向药物克挫替尼可W通过抑制ALK基因从而发挥遏制 肿瘤生长的作用，是第1个针对间变性淋己瘤激酶（ALK)进行祀向治疗的药物，用于治疗通 过FDA批准的检测方法诊断为ALK阳性的局部晚期或转移性非小细胞肺癌患者。2011年8 月美国食品药品管理局（FDA)批准克挫替尼用于EML4-ALK融合基因阳性的NSCLC的治疗。 2013年我国SFDA也批准了克挫替尼用于临床治疗NS化C。
[0003]巧光原位杂交技术（fluorescenceinsituhybridization,FISH)是基于放射性 原位杂交的一种非放射性分子细胞遗传技术，巧光标记取代了同位素。因为ALK基因重排 包括大的染色体片段插入和易位，所W选择巧光原位杂交（FISH)方法来检测所有类型的 ALK基因重排。该方法可W通过探针特异性标记细胞核中的ALK断裂点来检测ALK重排，进 而鉴别出EML4-ALK。相对于T肥和RT-PCR，FI甜具有高敏感性和高特异性的优势。目前 FISH是美国食品和药物管理局唯一批准的在应用克挫替尼前检测ALK基因重排的方法，是 检测EML4-ALK融合基因的金标准。
[0004] 目前市场上已有肺癌ALK基因重排的检测试剂盒，但是需要杂交试剂过长，通常 在16hW上，影响诊断效率。
【发明内容】
阳0化]本发明提供一种肺癌ALK基因重排快速检测巧光探针的制备方法及一种快速巧 光原位杂交液的配方。通过所述探针制备方法得到两组巧光探针分别位于ALK基因的3' 端的两侧，而此位置为ALK基因重排的活性热点，不仅能够EML4、TGF、KIF5B等多种基因与 ALK基因重排，而且能够检测目前尚未知其他基因与ALK基因重排从而启动ALK基因表达引 发的致癌检测。该方法、配方操作简单，特异性和敏感性高，可W快速、准确地检测出肺癌融 合基因，检测结果准确可靠，检测结果准确可靠，可为医师对肺癌进行分子分型提供参考依 据，适用于大规模推广应用。
[0006] 为实现上述目的本发明采用W下技术方案：
[0007] 一种肺癌ALK基因重排快速检测巧光探针，其特征在于，它的制备步骤如下：
[0008] (1)探针DNA的获取：选取含有ALK基因的BAC菌种经过划线接种、初始培养及过 夜培养之后，提取BAC菌种质粒；
[0009] 似酶切DNA:通过切口平移法酶切BAC菌种质粒DNA;
[0010] (3)连接反应：采用切口平移法对酶切好的DNA进行巧光标记，该连接体系在16°C 反应2. 5小时；
[0011] (4)沉淀DNA:采用乙醇沉淀法进行沉淀。
[0012] 上述（3)中该连接反应体系为：
[0013] lOxPolymcrasebuffer 5μ1 釣asmidDNA 3μΙ 日NascI 1,4μ1 DNApolymerase 2μ1 clNTP(A\C\G) 2.5μΙ dTTP 2.5μΙ Red-dUTP 5μ! ddH20 28.6μΙ 总体积 50μ1。
[0014] 所述反应体系中面asel的浓度为0. 01-0.lU每反应体系、DNApolymerase的浓度 为10-1抓每反应体系。
[0015] 所述反应体系中五种核巧酸的质量比例为dATP:dTTP:dCTP:dGTP:加TP= 3:2:3:3:2ο
[0016] 一种快速巧光原位杂交液的配方，其特征在于：由SSC、CTAB、去离子甲酯胺、葡聚 糖、人类胎盘DNA和水组成。
[0017] 所述2XSSC溶液的配制方法如下：NaCl175g和巧樣酸钢88g加地2〇溶解后定容 至1000ml，调PH至7. 4,高压灭菌，得20XSSC溶液，工作液稀释10倍后即得2XSSC。
[0018] 所述CTAB溶液由CTAB和水组成，CTAB的终浓度为1-lOmM;
[0019] 所述去离子甲酯胺溶液终浓度为45 % -60 % ;
[0020] 所述葡聚糖溶液由葡聚糖和水组成，葡聚糖的终浓度为2% -13% ;
[0021] 所述人类胎盘DNA的终浓度为10-100μg/ml。
[0022] 本发明的有益效果在于：
[002引 1.本发明提供的两组巧光探针分别位于ALK基因的3'端的两侧，而此位置为ALK 基因重排的活性位点，因此能够检测所有ALK基因重排的情况。同时本发明公开了制备所 述巧光探针的优化体系，使标记的探针具有最合适的巧光信号。
[0024] 2.通过优化探针制备过程及杂交液配方，可W将杂交时间由原来的1化缩短到 2h，大大提高了诊断效率，节约时间。
【附图说明】 阳0巧]图1为ALK基因重组检测巧光探针示意图；
[0026] 图2为ALK信号计数指南；
[0027] 图3为ALK信号特征指南。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，运些实施例仅用于说明本发明而不用 于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，操作 步骤如下：
[0029] 一、探针DNA的获取
[0030] 1.划线接种：将携带有ALK基因的BAC菌种划线接种于含有抗生素（氯霉素）的 琼脂平板上，37°C培养过夜（约14小时）；
[0031] 2.初始培养：次日挑取生长状态良好的单克隆菌种，接种于2ml含有抗生素（氯 霉素）的LB液体培养基中，37°C溫度下，摇速约20化pm，培养6-8小时；
[0032] 3.过夜培养：每1ml菌液转移至200ml培养体系，37°C溫度下，转速20化pm，培养 过夜（约14小时）；
[0033] 4.次日按照质粒大量提取试剂盒（0MEGABAC/PAC大型质粒提取试剂盒）操作说 明，进行DNA大量提取和纯化。
[0034] 二、探针标记
[0035] 1.探针巧光标记
[0036] 采用提取的质粒DNA进行巧光素标记。
[0037] 方法如下：
[0038] (1)取避光的EP管，先加入水，最后加入面asel和DNApolymerase(酶始终放在冰 盒或冰上）按如下反应体系反应：
[0039] 10、<Polymerasebui惊 5μ1 Plasmi-d日ΝΑ 3μ1 DNase1 1,4μ1 D.NApolymerase 2μ! dNTP(A\C\G) 2.5μ1 d-m， 2.5μ! Red-dUTP 5μ1 ddH20 28.6μ1 总体积 50μ1。
[0040] (2)所述反应体系中丽asel的浓度为0. 07U每反应体系、DNApol