对虾tsv和imnv荧光定量检测引物和探针及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及海洋生物病原检测，尤其是设及对邮桃拉病毒（TSV)和对邮传染性肌 肉坏死病毒（IMNV)巧光定量检测引物和探针及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 对邮桃拉病毒灯SV)和对邮传染性肌肉坏死病毒（IMNV)是引起养殖对邮发病 的两种常见的病毒性疾病。对邮桃拉病毒灯SV)为有包涵体，直径30nm，单链RNA病毒， 长度10. 2化；对邮传染性肌肉坏死病毒（IMNV)为有囊膜，直径40nm，双链RNA病毒，长度 7560bp，两种病毒均被国际兽医局（TheWorldOrganisationanimalHealth, 01巧列入 需要报告的水生动物病毒性疫病。凡纳滨对邮（P.vannamei)是两种病毒的易感宿主，而 凡纳滨对邮也是我国主要的对邮养殖品种，占养殖对邮总量的80%W上，对邮感染运两种 病毒后，均表现为不摄食、反应迟纯、肝膜腺肿大、抵抗力下降，一旦气候或环境因素发生变 化，极易造成对邮大面积死亡，从而造成严重经济损失。因此建立早期预警技术，加强苗种 和成邮检疫，对预防病毒感染，有效切断病毒传播，减少病害造成的损失至关重要。目前有 关病毒检测方法，包含组织病理学、电镜观察、原位杂交、PCR或RT-PCR、巧光定量等方法， 但传统检测方法操作繁琐费时、灵敏度低、不适合早期的预防检测；而PCR或RT-PCR相比 传统方法虽然灵敏度有了提高，但其后续的电泳，极易造成交叉污染，那么随着近几年来巧 光定量方法的应用和巧光标记物的发展，该方法通过对巧光信号的采集实现对PCR过程中 产物量的实时监测，可精确计算出初始模板量。同时，由于巧光信号引入，灵敏度比普通的 PCR提高10~100倍，不同病毒的检测可用不同的巧光素标记特异探针，运用多重巧光定量 PCR(qPCR)技术，可实现多种病毒的同时检测。
【发明内容】
[000引本发明的第一目的是提供二重巧光定量RT-PCR(RT-qPCR)引物和探针。
[0004] 本发明的第二目的是提供所述二重巧光定量RT-PCR(RT-qPCR)引物和探针在制 备检测对邮桃拉病毒（TSV)和对邮传染性肌肉坏死病毒（IMNV)制品中的应用。
[0005] 本发明的第Ξ目的是提供用于检测对邮桃拉病毒（TSV)和对邮传染性肌肉坏死 病毒（IMNV)二重巧光定量RT-PCR(RT-qPCR)试剂盒。
[0006] 本发明的第四目的是提供对邮桃拉病毒（TSV)和对邮传染性肌肉坏死病毒 (IMNV)的检测方法。
[0007] 所述二重巧光定量RT-PCR(RT-qPCR)引物和探针包括：
[0008] TSV上游引物：5 ' -AAGGAGCATTGTGGCTGTG-3，；
[0009] TSV下游引物：5 ' -CTTCAGACTGCAAGTTCATCTCA-3，；
[0010] TSV探针：FAM-AATAAGATGAATGCTAAGCAGA-MGB;
[0011] IMNV上游引物：GCTGATATGACGGCACAAAGAAG;
[0012] IMNV下游引物：CGTCGGCCCTAATAGAGTCATT;
[0013] IMNV探针出EX-CTGGTAATCATCTTCG-MGB。
[0014] 所述二重巧光定量RT-PCR(RT-qPCR)引物和探针可在制备检测对邮桃拉病毒 灯SV)和对邮传染性肌肉坏死病毒（IMNV)制品中应用。
[0015] 所述制品可为用于定量检测对邮桃拉病毒灯SV)和对邮传染性肌肉坏死病 毒（IMNV)的系列阳性标准品，所述系列阳性标准品分别含5X1〇1、5X1〇3、5X1〇5、 5X107copies/μL的对邮桃拉病毒灯SV)和对邮传染性肌肉坏死病毒αMNV)核酸片段。
[0016] 所述对邮桃拉病毒（TSV)和对邮传染性肌肉坏死病毒（IMNV)核酸片段，具体信息 如下：
[0017] TSV片段序列：
[001 引AAGCCACGCCATTTTTACAAGGAGCATTGTGGCTGTGGAATAAGATGAATGCTAAGCAGACATCAAT TATTCGACGCACTCTTACAGAACACCTACGCTCTATTACATCATTTCCTGGCATTGAGATGAACTTGCAGTCTGA AGCTCGAGCTA
[001引 IMNV片段序列：
[0020] GTAGATGAGCTAAGAGTATTAGCTGATATGACGGCACAAAGAAGCAACGTAAACACTGCTGGTAATCAT CTTCGTGATAATGACTCTATTAGGGCCGACGCTGTTCTAGCTAACAATACAGT
[0021] 所述阳性标准品可在制备检测对邮桃拉病毒灯SV)和对邮传染性肌肉坏死病毒 (IMNV)的制品中应用。
[0022] 一种用于定量检测对邮桃拉病毒灯SV)和对邮传染性肌肉坏死病毒（IMNV) 的试剂盒，所述试剂盒包括所述二重巧光定量RT-PCR(RT-qPCR)引物和二重巧光定量 RT-PCR(RT-qPCR)探针。
[0023] 所述试剂盒还包括用于定量检测对邮桃拉病毒（TSV)和对邮传染性肌肉坏死病 毒（IMNV)的系列阳性标准品，-20°C保藏，用于标准曲线绘制。
[0024] 所述试剂盒还包括W下组分：
[00巧]1) 2XRT-qPCR反应液，所述2XRT-qPCR反应液内含有耐热DNA聚合酶（TaqDNA polymerase)、反牵专录酉每（SuperscriptIIIReverseTranscriptase)，-20°C保藏；
[0026] 2)重蒸水，重蒸水用于阴性对照（NTC)实验，检测试剂盒所含的试剂和操作过程 是否污染，-20°C保藏。
[0027] 所述对邮桃拉病毒灯SV)和对邮传染性肌肉坏死病毒（IMNV)的检测方法，采用所 述用于定量检测对邮桃拉病毒（TSV)和对邮传染性肌肉坏死病毒（IMNV)的试剂盒，具体步 骤如下：
[0028] 1)病毒核酸的提取：按照商品化核酸RNA提取试剂盒QIAGENViralRNAMini ExtractionKit(QIAGEN，Cat# :52904)操作，从活样品组织中提取病毒RNA;取2μL提取的 病毒RNA作为RT-qPCR模板，同时做一份阴性对照，所述阴性对照可取适量重蒸水或无TSV 和IMNV感染的邮组织，与样品同时进行W上核酸提取，W便评估核酸提取过程中是否存在 交叉污染；
[0029] 2)扩增检测在至少二通道巧光定量PCR仪上进行，总体积20μL，其中2XRT-qPCR 反应液10μL，引物和探针混合液8μL，2μL检测样品（重蒸水、阳性系列、阴性对照、提取 产物）；探针检测模式设置为RepOTterDye:FAM、肥X通道，分别用于检测TSV和IMNV;扩 增条件50°ClOmin，1个循环，95°C2min，1个循环，94°C15s，60°C40s，40个循环；设置完成 后，保存文件，运行程序；
[0030] 3)巧光定量结果报告：首先对标准曲线进行归一化，评价扩增效率，扩增效率应 保持在90%~105%，标准曲线的R2> 0. 990,阴性对照、重蒸水的扩增曲线应没有对数增 长期，即Ct值> 40 ;然后进行样品数据分析，通过样品的Ct值与标准曲线进行比较，仪器将 自动计算并显示待测样品的拷贝数，即能换算出组织所含的病毒数。
[0031] 本发明根据GenBank已收录的全长或部分基因组序列，经过比对选择一段较为保 守的序列设计特异性引物和化qman-MGB探针；分别克隆了两种病毒片段，通过体外转录方 法获得病毒RNA片段，作为阳性对照标准品，本发明还提供了一种包含反转录酶和DNA聚合 酶的试剂，一步即能完成反转录和扩增，完全闭管操作，减少污染，实现对邮桃拉病毒（TSV) 和对邮传染性肌肉坏死病毒（IMNV)的快速定量分析。
[003引本发明W对邮桃拉病毒（TSV)和对邮传染性肌肉坏死病毒（IMNV)的保守序列，设 计两对引物，两条巧光标记化qMan-MGB探针，利用二重实时巧光定量RT-PCR(RT-qPCR)技 术，操作简单规范，灵敏度高，特异性好，适合苗种筛选和养成期快速检测。
【附图说明】
[003引图1为TSV扩增曲线。在图1中，1~5 :阳标加入量分别为108、106、104、102拷贝。 [0034] 图2为图1TSV扩增曲线所对应的标准曲线。
[003引 图3为IMNV扩增曲线。在图3中，1~5 :阳标加入量分别为108、106、104、102拷 贝。
[0036] 图4为图3IMNV扩增曲线所对应的标准曲线。
【具体实施方式】
[0037] W下通过实施例和附图对本发明作进一步说明。
[003引1.阳标片段的确定与引物和探针的设计：
[0039] 根据GenBank已收录的全长或部分基因组序列，经过比对选择一段较为保守的序 列确定为阳标片段，并设计特异性引物和化qman-MGB探针，委托上海基康生物技术有限公 司合成。
[0040] 将上述引物和探针用重蒸水（RNase，面ase-化ee)配制成混合液，每条引物和探 针浓度均为0. 625μmol/l，
[0041] 2.阳性标准品的制备：
[0042] 将两种病毒片段分别克隆至PUC57载体上，通过体外转录方法