一种柯萨奇病毒a16型、肠道病毒71型核酸荧光pcr检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及核酸巧光PCR检测试剂盒，尤其设及柯萨奇病毒A16型/肠道病毒71 型核酸巧光PCR检测试剂盒，属于手足口病的体外诊断领域。
【背景技术】
[0002] 手足口病（Hand-化ot-mouthdisease，HFMD)又名发疹性水瘤口腔炎，是由一组肠 道病毒引起的常见传染病，临床表现W发热和手、足、口腔等部位的皮疹为主要临床特征的 一种急性传染病。绝大多数HFMD患者预后良好，一般可在5~7天痊愈，属于自限性疾病。 病毒还可W侵犯呼吸系统、中枢神经系统等引起脑炎、肺水肿、弛缓性麻搏、屯、肌炎等症状， 个别危重患儿可因多种原因导致死亡。该病全年均可发病，好发于夏秋季，常见于5岁W下 的儿童。HFMD的主要传播途径是粪-口途径，亦可通过呼吸道传播。HFMD传染性强，易导 致流行或暴发。HFMD分布极广泛，无严格地区性。HFMD全年均可发病，有明显的季节特点， W夏秋季多见。
[0003] 引起HFMD的主要为小核糖核酸病毒科（Picornaviridae)肠道病毒属的柯萨奇病 毒（Coxsackievirus)A组的4型、5型、7型、9型、10型、16型；柯萨奇病毒B组的2型、5型； 部分埃可病毒巧CHO-viruses)和肠道病毒71型。最常见为柯萨奇病毒A组16型（CoxAie) 及肠道病毒71型巧V71)。人对引起HFMD的肠道病毒普遍易感，各年龄组均可感染发病，但 W隐性感染为主，隐性感染与显性感染之比约为100 : 1。由于机体受病毒感染后，产生的 中和抗体可在体内存留较长时间，对同型病毒感染产生牢固的免疫力，因此，HFMD的患者主 要为学龄前儿童，尤其是5岁W下儿童，占发病数90%W上。而大多数成人可携带病毒但不 发病。1岁W内的儿童发生屯、肌炎、脑炎等重症的比例较1岁W上儿童高。
[0004] 中国手足口病流行，1981年上海首次报道手足口病；1983年天津发生CoxAie引起 的手足口病暴发；1995年武汉病毒研究所从手足口病人中分离出EV71 ;1998年中国台湾地 区129106例HFMD，其中405例为严重的中枢神经系统感染，78例死亡；1999年W来，中国 广东、福建、上海、重庆等地区报告局部流行EV71感染；2007年山东临巧流行WEV71为主 的手足口病；2008~2009年安徽阜阳、河南、山东等地大规模流行。主要为CoxAie和EV71 共循环引起手足口病发，EV71在大部分省市为优势病毒。
[0005] 国内已有多种基于实时巧光定量PCR技术定量检测CA16、EV71RNA的试剂盒应用 于临床检测中，运些试剂盒所提供的RNA提取方法主要是酪-氯仿法和柱提取法。该类试 剂盒存在很多不足之处：1)检测灵敏度低，约在lOOOcopie/ml左右；检测范围窄，一般在 1. 00E+03copie/ml~1. 00E+07copie/ml之间，对于临床高值（大于 5. 00E+07copie/ml) 和低值（小于1.00E+03copie/ml)的样本无法检测；2)对于CA16\EV71的不同亚型存在一 定的漏检现象；3)酪-氯仿法是最经典的RNA提取方法，但是操作繁琐，对于设备和人员操 作要求高，低病毒载量的标本检出率低，且所用试剂具有一定的毒性；柱提取方法无需高速 离屯、，但是需频繁更换离屯、管，用时长，特异性较差；4)无法有效去除样本中的PCR抑制物 (如：全血、疲液等），体系中一般没有阳性内对照（即内标），无法预防假阴性；5)国外试 剂成本和耗材成本太高，很难在临床广泛开展。6)国内大部分试剂只能做单管检测，检测2 个型需要用两管反应液。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于解决现有柯萨奇病毒A16型（CA16)、肠道病毒71型巧V71)巧 光定量PCR检测试剂盒的缺陷，提供一种RNA提取得率高、检测灵敏度高、检测范围宽而准 确的CA16/EV71核酸巧光PCR检测试剂盒，可W对咽拭子等未知样本中的CA16\EV71-RNA 在一管反应液中进行快速、准确检测，并且可W区分CA16和EV71基因型，检测结果可用于 CA16/EV71感染的辅助诊断。
[0007] 本发明实施例中提供了一种柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型核酸巧光PCR检 测试剂盒，包括W下各组分：RNA提取溶液、RNA洗脱液、内标、PCR反应液、CA16/EV71酶 混合液、CA16/EV71阳性对照、CA16/EV71阴性对照，其中，所述内标为插入PUC18T载体 的一段长为90碱基对的人工合成DNA序列的重组体，其浓度为1. 00E+03copies/ml~ 1. 00E+06copies/ml;所述90碱基对的序列为：
[0008] 日'-CAGCTTGTTGTAACAAAGCATCCGCTCCCCCATTCATGTTGCTGGGTACAGACAGTTACCTCTCCA CTAGGCAAATCTCAACAGGATCAG-3' 。
[0009] 优选的，上述的检测试剂盒，其中，所述RNA提取溶液包括如下组分：
[0010] RNA提取溶液I:十二烷基硫酸钢，质量/体积0. 3 %~1. 2 %、曲拉通，体积/体积 1. 0 % ~5. 0 %，异硫氯酸脈 0.Imol/L~1. 2mol/l、50μg/ml~350μg/ml的磁珠；
[0011] RNA提取溶液II:4-?乙基赃嗦乙横酸150mmol/L~350mmol/L、p册.5 + 0. 2,氯 化钢 150mmol/L~400mmol/L;
[0012] RNA提取溶液III:曲拉通，体积/体积0. 5 %~3. 0 %、氯化钢lOOmmol/L~ 400mmol/L；
[001引 RNA提取溶液IV:矿物油。
[0014] 优选的，上述的检测试剂盒，其中，所述RNA洗脱液为Tris-HCl0. 5mol/L~ 1. 5mol/L、EDTA0. 2mol/L~1. 5mol/L。
[0015] 优选的，上述的检测试剂盒，其中，所述PCR反应液为5XPCR反应缓冲液10μ1， 2mmol/L脱氧核糖核巧Ξ憐酸，0. 1ymol/L~0. 5ymol/L用于祀多核巧酸扩增的上下游引 物CA16-F、EV71-F与CA16-R、EV71-R，0. 1μmol/L~0. 5μmol/L用于祀多核巧酸检测的探 针CA16-P、EV71-P，0.lymol/L~0. 4ymol/L用于检测内标的上下游引物IC-F与IC-R， 0. 1ymol/L~0. 4ymol/L用于检测内标的探针IC-P。
[0016] 优选的，上述的检测试剂盒，其中，所述用于祀多核巧酸扩增的上下游引物W及用 于祀多核巧酸检测的探针，其碱基对序列分别为：
[0017] CA16 上游引物CA16-F:5' -TATGTTAATTGGGACATTGATTTGA-3' ；
[0018] 〔416下游引物〔416-尺：5'-40：4176661'1766(：了4〔6-3'；
[0019] CA16 探针CA16-P:5' -FAM-ATATGCTCAGCTGCGGCGG-B册 1-3' ；
[0020] EV71 上游引物EV71-F:5' -TCCCACATTCGGAGAACACA-3' ；
[0021] EV71 下游引物EV71-R:5' -AAGGGTACTTGGACTTGGAGGT-3' ；
[0022] EV71 探针EV71-P:5' -肥X-AGGAGAAAGATCTTGAATACGGGGC-B册 1-3'。
[0023] 优选的，上述的检测试剂盒，其中，所述用于检测内标的上下游引物W及用于检测 内标的探针IC-P，其碱基对序列分别为：
[0024] 内标上游引物IC-F:5' -CAGCTTGTTGTAACAAAGCA-3' ；
[00巧]内标下游引物IC-R:5' -CTGATCCTGTTGAGATTTGCC-3' ；
[0026] 内标探针IC-P:5'ROX-CTCCCCCATTCATGTTGCTGGG-B册 13'。
[0027] 优选的，上述的检测试剂盒，其中，所述CA16/EV71酶混合液为mMLV酶10U/μ1~ 150U/μ1，H-TaqDNA聚合酶 1U/μ1 ~10U/μ1。
[002引优选的，上述的检测试剂盒，其中，所述CA16/EV71阳性对