H10n8亚型禽流感病毒二重rt-pcr检测引物组、试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于禽类病毒检测技术领域，尤其设及一种H10N8亚型禽流感病毒二重 RT-PCR检测引物组、试剂盒，化及鉴定化0亚型禽流感病毒、N8亚型禽流感病毒的引物对或 引物对组及其试剂盒。
【背景技术】
[0002] 禽流感病毒（AvianInfluenzaVi;rus，AIV)根据表面糖蛋白化emagglutinin，HA) 和神经氨酸酶（Neuraminidase,ΝΑ)抗原性差异分为不同的亚型，目前已发现有18种HA亚 型化1-H18)和11种NA亚型（N1-N11)。AIV是一种有包膜、单股负链、分节段的RNA病毒， 病毒基因组由8个分节段负链RNA组成。AIV基因组的分节段特性使得两种或两种W上不 同亚型流感病毒共同感染一个细胞时，子代病毒在装配时其核酸片段可能W同源交换的形 式发生基因重排而导致抗原转变，从而产生能引起大流行的新流行株。
[0003] 2013年12月6日，江西省南昌市一名73岁女子罹患H10N8亚型禽流感，因呼吸衰 竭、休克死亡，运是全球首例人类感染H10N8的死亡案例。2014年1月25日，也是在南昌， 又确诊一例H10N8亚型禽流感。
[0004] 目前，急需建立一种快速检测H10N8禽流感病毒的方法及开发相应试剂。
【发明内容】
阳0化]本发明要解决的技术问题是提供一种H10N8亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测引 物组、试剂盒及其应用。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明采用W下技术方案：
[0007] 一种用于鉴定化0N8亚型禽流感病毒的引物组，包括2对特异性引物，分别是引物 对H10-1和H10-2、引物对N8-1和N8-2,其分别具有如沈QIDNo. 1至沈QIDNo. 4所示 的序列。
[0008] 一种用于鉴定H10亚型禽流感病毒的引物对，包括特异性引物H10-1和化0-2,它 们分别具有序列表SEQIDNo. 1至SEQIDNo. 2的碱基序列。
[0009] -种用于鉴定N8亚型禽流感病毒的引物对，包括特异性引物N8-1和N8-2,它们分 别具有序列表SEQIDNo. 3至SEQIDNo. 4的碱基序列。
[0010] 一种H10N8亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测试剂盒，包括反转录试剂、PCR试剂、 DEPC水和无RNA酶的超纯水，所述的PCR试剂中含有2对特异性引物，其分别具有如SEQID No. 1至沈QIDNo. 4所示的序列。
[0011] 作为优选，所述的特异性引物H10-1和化0-2,N8-1和N8-2在所述的PCR试剂中 的终浓度为0. 1-0. 8μM。
[0012] 作为优选，所述的反转录试剂每管16μL其中SXReverseTranscriptase Buffer10μL、50pmol9merRandomPrimer2μL、10mMdNTPMixture2μL、40U RibonucleaseInhibitor1μL、5U/μLAMVReverseTranscriptaselμL。
[0013] 作为优选，所述的PCR试剂的体积为26. 2μL/管，其中包含2XEasy化qTMPCR SuperMix25μL，50μΜHlO-1 和HlO-2 引物各 0. 2μL、50μΜN8-1 和N8-2 引物各 0. 4μL。
[0014] 本发明还提供了所述的用于鉴定H10N8亚型禽流感病毒的引物组、所述的引物对 或所述的H10N8亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测试剂盒在鉴别H10N8亚型禽流感病毒、 H10亚型禽流感病毒和N8亚型禽流感病毒中的应用。 阳015] 本发明具有如下有益效果：
[0016] 1.发明人专口针对化0亚型禽流感病毒HA基因、N8亚型禽流感病毒NA基因设计 了 2对特异性引物，组合成H10N8亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测试剂盒，一管检测即可 确定是否为H10N8亚型禽流感病毒、H10亚型禽流感病毒和N8亚型禽流感病毒的感染。利 用本发明的引物对、引物对组或试剂盒，可W检测待测样品中是否含有H10N8亚型禽流感 病毒、H10亚型禽流感病毒和N8亚型禽流感病毒感染。本发明建立了一次RT-PCR反应就 能同时检测和鉴别H10亚型禽流感病毒、N8亚型禽流感病毒、H10N8亚型禽流感病毒的二 重RT-PCR检测试剂盒。通过扩增条件优化、特异性和敏感性试验，建立H10亚型禽流感病 毒和N8亚型禽流感病毒的二重RT-PCR检测试剂盒，该试剂盒具有特异性强、灵敏度高、低 成本、高效率等优点，可用于临床检测H10N8亚型禽流感病毒。
[0017] 2.由于本发明在引物设计上利用扩增片段长度的不同直接判定扩增结果，使得该 法在结果判定时更简便、直观和实用。实验证明，该法对同一样品中的H10亚型禽流感病毒 和N8亚型禽流感病毒模板进行扩增，结果均得到与试验设计相符的267bp化10亚型禽流感 病毒）、464bp(N8亚型禽流感病毒）的特异性扩增条带，对新城疫、传染性支气管炎和传染 性喉气管炎常见禽病的检测全为阴性。敏感性试验结果表明，该法最低能检测到1〇3拷贝/ μL的H10亚型禽流感病毒、N8亚型禽流感病毒。
[0018] 3.本发明可为Η10亚型、Ν8亚型、Η10Ν8亚型禽流感病毒的发病早期提供准确的 诊断结果，对切断其传播途径有重要意义，可及时隔离与处理，对Η10Ν8亚型禽流感的有效 防控具有重要意义，应用前景广阔，对养禽业可持续发展也有重要现实意义。
【附图说明】
[0019] 图1为本发明所建立Η10Ν8亚型AIV二重RT-PCR检测试剂盒的特异性试验结果 图；
[0020] 其中：M-DLlOOOMarker;1-H10+N8 ;2-H10N7 ;3-册N8 ;4-HlNl;5-H2N3 ;6-册N2 ; 7-H4N6 ;8-H5Nl;9-H7N2 ;10-册N4 ;11-朋N2 ;13-H12N5 ;14-H13N6 ;15-H14N5 ; 16-H15N9 ;17-NDV;18-IBV;19-ILTV;20-空白对照。 阳02U 图2为本发明所建立H10N8亚型AIV二重RT-PCR检测试剂盒的敏感性试验结果 图；
[0022]其中：M-DLlOOOMarker;1-1〇8拷贝/μL;2-1〇7拷贝/μL;3-1〇6拷贝/μL;4-1〇5 拷贝 /μL;5-1〇4拷贝 /μL;6-10 3拷贝 /μL;7-100 拷贝 /μL;8-10 拷贝 /μL;9-空白对 照。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施方式并不 局限于实施例表示的范围。运些实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。此 夕F，在阅读本发明的内容后，本领域的技术人员可W对本发明作各种修改，运些等价变化同 样落于本发明所附权利要求书所限定的范围。
[0024] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所 使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 阳0巧]AIV毒株化3N8、册N8、H1N1、册N2、H4N6、H9N2 和H11)、NDV、IBV和ILTV由广西兽 医研究所分离鉴定保存；AIV毒株化2N3、册M、H10N3、H12N5)由香港大学惠赠；AIV毒株 的RNA化10N7、册Nl、H7N2、H13N6、H14N5和H15N9)由美国康涅狄格州大学惠赠。Minibest viralRNA/DNAextractionkitver. 4.0和反转录试剂购自大连宝生物公司；胶回收试剂 盒购自Axygen公司；PCRSuperMix购自北京全氏金生物公司。
[0026] 连施例1:禽流威病毒二電RT-PCR引物设计及试剂盒的制备
[0027] (1)引物的设计
[0028] 根据GenBank中H10、N8亚型AIVHA和NA基因，用DNAStar软件比对序列找出保 守区域，用Primer5.0软件分析引物的扩增条件，通过NCBIBlast验证，设计并合成了 2 对特异性引物（见表1)，用于H10亚型禽流感病毒和N8亚型禽流感病毒的检测。 W29] 表1引物信息
[0030]
[0031] 注：AIVH10-1和H10-2引物对用来检测是否含有化0