免疫原性肽缀合物及以之诱导抗流感治疗性抗体应答的方法
【专利说明】免疫原性肽缀合物及以之诱导抗流感治疗性抗体应答的方 法
[0001] 相关申请的交叉引用 本申请是2013年3月14日提交的美国顺序号13/828,988的部分继续申请，其通过引 用以其整体结合到本文中。 发明领域
[0002] 本发明涉及免疫原性流感血凝素 A2 (HA2)来源的肽缀合物和使用所述缀合物诱 导针对流感病毒的特异性抗体应答的方法。
[0003] 序列表并入 本申请的生物学序列信息包含于与本申请一起提交的ASCII文本文档中，所述ASCII 文本文档的文件名为"TU-271-5-SEQ. txt"，创建于2013年3月14日，文件大小为29, 368 字节，其通过引用结合到本文中。
[0004] 发明背景 血凝素（HA)是流感病毒（正黏病毒）的包膜蛋白，并且是原型RNA病毒I类融合蛋 白。HA在感染细胞中作为前体蛋白HAO产生，所述HAO被蛋白水解裂解成2种蛋白质，称 为HAl和HA2。HA2含有氨基端疏水结构域，被称为融合肽，它在血凝素前体蛋白裂解时被 暴露出来。除融合肽以外，逆转录病毒跨膜蛋白还含有几个与HA2已知结构一样的结构特 征，包括延长的氨基端螺旋（N-螺旋，通常为"七残基重复序列"或"亮氨酸拉链"）、羧基端 螺旋（C-螺旋）和跨膜结构域近端的芳族基序。这5种结构域中至少4种的存在将病毒包 膜蛋白界定为I类融合蛋白。
[0005] 图1显示6个I类病毒家族的融合蛋白的6个已鉴定的结构域。融合蛋白起源 于疏水融合肽，终止于锚肽，并整合了延长的氨基端α-螺旋（N-螺旋，通常为"七残基重 复序列"或"亮氨酸拉链"）、羧基端α-螺旋（C-螺旋）和有时病毒体包膜近端的芳族基 序。第6个结构域，本文称为融合起始区（FIR)，公开于美国专利号7, 491，793和美国专利 号8, 222, 204 (属于Garry和Wilson)，它们的每一个通过引用以其整体结合到本文中。
[0006] 存在多个甲型流感病毒亚型。各病毒亚型包含包埋在病毒的脂质膜包膜中的两种 糖蛋白的一种特定形式组合。两种界定亚型的糖蛋白为血凝素 HA和神经氨酸酶（NA)。有 17种已知的HA变体，分别被称为Hl至H17,并有9种已知的神经氨酸酶变体，被分别称为 Nl至N9。各个病毒亚型的特定特征分别在于其血凝素和神经氨酸酶变体号。例如，甲型流 感亚型H3N2为猪流感，亚型H5N1为禽流感。
[0007] 每年大约10-20%的美国人口罹患季节性流感。虽然大多数个体在1-2周内从流 感中恢复，但是极年幼者、老年人和患有慢性医学病况的人可发展出流感后肺炎和其它致 死并发症。流感的致病物质是流感病毒，通过分段的病毒基因组的再分布和突变过程容易 发展出新毒株的正黏病毒。
[0008] I类病毒的FIR是参与病毒包膜-宿主细胞膜融合的病毒融合包膜蛋白的区域，所 述融合是结合宿主细胞膜的病毒籍以打断宿主细胞膜的完整性以将病毒的遗传物质注入 宿主细胞中的过程。该过程包括病毒包膜和宿主细胞膜的合并，这是由病毒融合蛋白（例 如在流感病毒的情况下为血凝素）介导的，因此将宿主细胞的内部暴露于病毒的内部。如 上述美国专利号7, 491，793和美国专利号8, 222, 204 (属于Garry和Wilson)所公开的一 样，包含FIR区段或由FIR区段组成的相对短的肽可与病毒融合蛋白结合，并干扰融合发生 所需要的构象变化。所述肽因此防止宿主细胞被病毒感染，尽管事实是病毒仍可与宿主细 胞膜的表面结合。因此，FIR肽通过与传统疫苗治疗相比完全不同的机制抑制病毒感染性， 传统疫苗治疗一般包括产生防止病毒与宿主细胞结合的抗体，而不是干扰包括病毒融合机 制本身的生物化学事件。
[0009] 甲型流感病毒高毒力毒株可产生流行病和大流行病。近年来，出现了能够引起高 死亡率的甲型禽流感病毒亚型H5N1的高致病性毒株。应对由流感病毒造成的对公共健康 和作为生物恐怖活动潜在物质二者的威胁是极优先考虑的事。因此，有研发控制季节性流 感及大流行性流感和武器化流感的威胁增加的治疗组合物和方法的持续需要。本文所述的 肽缀合物、抗体致力于这些需要。
[0010] 发明概述 本文所述免疫原性流感血凝素来源的肽缀合物诱导针对流感病毒的特异性治疗性抗 体应答。如本文所述，免疫原性肽缀合物包含通过连接基团与载体蛋白（例如免疫原性载 体蛋白）缀合的血凝素（HA)融合起始区（FIR)肽或其变体。HA FIR肽由不超过50个氨 基酸残基组成，并包含流感血凝素2蛋白的区段，所述区段包括SEQ ID NO: 1或与之共享 至少50%序列同一性且以选自以下的一个或多个氨基酸取代之差不同于SEQ ID NO: 1的 SEQ ID NO: 1 的变体的氨基酸序列：V1I、V1L、V1A、V1G、V1T、V1S、V1M、E2D、E2K、E2R、D3E、 T4G、T4S、T4Q、T4A、K5F、K5M、K5I、K5V、K5L、K5A、I6L、I6V、I6A、I6T、I6S、I6Q、I6N、D7E、 L8I、L8V、L8A、W9Y、S10T、S10G、S10A、S10M和E14K。在一些实施方案中，流感血凝素2蛋白 的区段包括来自选自以下甲型流感亚型的血凝素2蛋白的多达25个其它氨基酸残基：H1、 H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16 和 H17。在所选甲型流感亚 型的血凝素2蛋白的氨基酸序列中其它残基与SEQ ID NO: 1或其变体邻接。任选HA FIR 肽可包括不是来自甲型流感血凝素2蛋白的一个或多个肽序列。
[0011] 本文所述免疫原性肽缀合物可用于治疗或预防流感感染并用于引起干扰流感病 毒-宿主细胞膜融合的流感特异性治疗性抗体。可将肽缀合物配制在可用于治疗或预防广 谱的流感感染的药物组合物中。本文所述免疫原性肽缀合物可用于治疗或预防流感感染并 用于引起干扰流感病毒-宿主细胞融合的流感特异性治疗性抗体。可将肽缀合物配制在与 药学上可接受的载体组合，任选包括一种或多种佐剂、赋形剂等的可用于治疗或预防流感 感染的药物组合物中。
[0012] 在一个实施方案中，免疫原性流感血凝素来源的肽缀合物的血凝素 FIR肽由SEQ ID NO: I (SEQ ID NO: 2的残基84-99,其是甲型流感亚型H3血凝素2的代表性序列）或 其变体组成。
[0013] 本文所述任何免疫原性肽缀合物的载体蛋白部分可以是任何蛋白质或多肽分子， 优选当给予受试者时可引起免疫反应（例如抗体产生）的蛋白质或多肽分子。所述多肽的 非限制性实例包括例如KLH、鲍鱼血蓝蛋白（CCH)、牛血清白 蛋白（BSA)、阳离子化BSA、卵清蛋白、流感血凝素蛋白等。所述免疫原性蛋白质是本领域众 所周知的。
[0014] 本发明的另一个方面是本文所述免疫原性肽缀合物在治疗或预防流感感染的方 法中的用途。所述方法包括将肽缀合物（例如以治疗有效剂量）给予受试者。肽缀合物刺 激受试者的免疫系统以产生特异性靶向缀合物的FIR肽部分的治疗性抗体。这种治疗性抗 体应答发生，尽管事实上当给予受试者时，仅FIR肽（无载体蛋白）不引起任何免疫应答。 如果需要，免疫原性肽缀合物可与药学上可接受的载体组合包含在药物组合物中。
[0015] 本发明的另一个方面是分离的治疗性抗体，所述抗体能够抑制结合细胞的流感病 毒与病毒与之结合的细胞的膜融合。优选治疗性抗体是人单克隆抗体、人源化单克隆抗体 或嵌合单克隆抗体。所述治疗性抗体可例如通过如下获得：从用本文所述免疫原性肽缀合 物治疗的患者的血清中分离抗体，产生来自已用（即给予）免疫原性肽缀合物处理的人类 受试者的重组形式的人抗体，或产生来自已用（即给予）免疫原性肽缀合物治疗的合适的 非人类宿主动物（例如兔或山羊）的重组嵌合或人源化形式的抗体。
[0016] 提供下列非限制性实施方案以说明本发明的某些方面和特征。
[0017] 实施方案1是一种免疫原性肽缀合物，其包含通过连接基团与载体蛋白（例如免 疫原性载体蛋白）缀合的血凝素（HA)融合起始区（FIR)肽或其变体；其中HA FIR肽由不 超过50个氨基酸残基组成，并包含流感血凝素2蛋白的区段，所述区段包括SEQ ID NO: 1 或与之共享至少50%序列同一性且以选自以下的一个或多个氨基酸取代之差不同于SEQ ID NO: 1 的 SEQ IDN0: 1 的变体的氨基酸序列：V1I、V1L、V1A、V1G、V1T、V1S、V1M、E2D、E2K、 E2R、D3E、T4G、T4S、T4Q、T4A、K5F、K5M、K5I、K5V、K5L、K5A、I6L、I6V、I6A、I6T、I6S、I6Q、 I6N、D7E、L8I、L8V、L8A、W9Y、S10T、S10G、S10A、SlOM 和 E14K。
[0018] 实施方案2包括实施方案1的免疫原性肽缀合物或由其组成，其中流感血凝素2 蛋白的区段包括来自选自以下甲型流感亚型的血凝素2蛋白的多达25个其它氨基酸残基： HI、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16 和 H17,所述其它残基 在所选甲型流感亚型的血凝素2蛋白的氨基酸序列中与SEQ ID NO: 1或其变体邻接。
[0019] 实施方案3包括实施方案1或实施方案2的免疫原性肽缀合物或由其组成，其中 HA FIR肽包括不是来自甲型流感血凝素2蛋白的一个或多个肽序列。
[0020] 实施方案4包括实施方案1-3中任一个的免疫原性肽缀合物或由其组成，其中血 凝素 FIR肽具有由SEQ ID NO: 1或与之共享至少50%序列同一性且