共交联磷酸盐化的和/或磷酸盐官能化的聚多糖类水凝胶的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基于透明质酸的水凝胶领域。特别地，本发明涉及通过透明质酸与葡 聚糖的共交联获得的磷酸化水凝胶，及其制备方法。本发明还涉及所述水凝胶用于活性成 分和细胞的封装和缓释的用途，所述活性成分和细胞用于人类和兽医再生医学。
【背景技术】
[0002] 玻尿酸或透明质酸（CAS No. 9004-61-9,在本文中也缩写为HA)属于粘多糖家族。 其为二糖聚合物，更具体地为线性非硫酸化粘多糖，其中包含通过交替的β_1，4和β-1，3 糖苷键结合在一起的葡萄糖醛和N-乙酰基-D-葡糖胺D-酸的重复单元（参见Tammi 等人在 Progress in Histochemistry&Cytochemistry 杂志上发表的文南犬"Hyaluronan metabolism in skin"，29 (2): 1-81，1994)。
[0003] 透明质酸发现于许多哺乳动物的组织中，更具体地在细胞外组织基质中。由于其 结合水分子的能力，其主要作用是组织的水合作用。如果其分子量超过约2MDa并且其质量 分数超过约0. 1 %，其会形成水凝胶；根据其分子量和质量分数，它以这种形式存在于某些 组织中，例如关节中，尤其是关节滑液中。它还具有其它作用，例如对诸如细胞迀移、组织分 化、血管再生和免疫细胞调节等生物现象的调节作用。因此，现有技术基于其分子量将该分 子归于完全不同的功能。
[0004] 透明质酸在体内经一组酶（称为透明质酸酶）分解（参见K. S. Girish和 K. Kemparaju 在 Life Sciences 杂志上发表的文章 "The magic glue hyaluronan and its eraser hyaluronidase:A biological overview"，80(2007 年），ρ· 1921 至 1943);也有其 它酶参与这一过程。
[0005] 基于透明质酸的水凝胶是已知的，并且用于很多医疗应用中，特别是以注射形式 用于皮肤重建、美容外科及皮肤科、或者用于软骨和骨关节的重建的矫形术（例如，用于膝 关节的粘弹性补充治疗）。它们也可以用作细胞培养基用于研究和细胞治疗，或者用于化学 治疗。
[0006] 根据其制备方法和用途，基于透明质酸的可注射的水凝胶可以分为三种不同的类 别：
[0007] - "导电"水凝胶，包含单独的交联透明质酸（HA)或者与其它聚合物结合的透明质 酸，用于在整容手术或粘弹性补充治疗（体内平衡的恢复）中填充皱纹；
[0008] - "诱导"水凝胶，包含交联透明质酸，含有生长因子和/或其它所谓的生物活性分 子，用于在原位传递中控制它们；
[0009] -用于细胞移植的水凝胶，由多种组分构成：聚合物、蛋白质和细胞。
[0010] 对于人类医学或兽医学的用处，水凝胶必须满足多种标准（参见Μ. Ν. Collins和 C. Birkinshaw发表的文章 "Hyaluronic acid base scaffolds for tissue engineering-A review"，Carbohydrate Polymers 92 (2013)，1262-1279, 2013 ;GD Prestwich 发表的文 章 "Hyaluronic acid-based clinical biomaterials derived for cell and molecule delivery in regenerative medicine'，，J. Controlled Release 155 (2011)，193-199) 〇 例 如，水凝胶必须是可生物降解的、生物相容的以及可再吸收的；而且它必须易于在生理条件 下使用。
[0011] 通常，术语"生物相容性"是指非生物材料与生物系统相互作用的这样一种能力， 要求其通过对宿主具有适当的反应以满足特定功能。
[0012] 长期以来胶原蛋白（糖蛋白家族）被用作可再吸收的、可注射的填充物。然而，胶 原蛋白存在某些缺点，包括出现过敏反应、以及在体内快速降解的风险。
[0013] 这些都是其被透明质酸盐替代的原因，无论其来源和制备方法（动物、生物技 术），透明质酸盐没有任何过敏反应并且是生物相容的。
[0014] 当前，透明质酸水凝胶，特别是其盐和/或衍生物，已广泛应用于化妆品领域，特 别是用于填充皱纹和皮肤缺损。
[0015] 透明质酸及其盐可以单独用于水凝胶的制备，也可以与其它聚合物（胶原蛋白、 明胶、壳聚糖、硫酸软骨素等等）组合使用，以促进不同组分的协同作用，并且更可靠地模 拟细胞外基质。
[0016] 由于沿着所述链存在的羧基、羟基和乙酰胺官能团，透明质酸可以经化学改性。一 方面，这些基团可以用于交联；另一方面，这些基团也可以用于官能化，以提供新的生物性 能或改善固有的生物和/或物理化学性质。交联涉及两个多糖链之间和/或同一个链的两 个部分之间键的形成。其导致粘度和/或分子量增加，并且驱动其它物理和物理化学性质 的改性。
[0017] 因此，由透明质酸制备水凝胶具有多种可能性。
[0018] 文献FR 2918377描述了一种粘性共交联凝胶，其包含至少一个第一强交联多糖 凝胶、和至少一个第二弱交联多糖凝胶，所述第一凝胶通过共价键与第二凝胶结合。强交联 凝胶和弱交联凝胶优选地基于透明质酸钠；交联剂为1，4- 丁二醇二缩水甘油醚（BDDE)。
[0019] 文献US 6586493描述了一种水凝胶，其得自包含部分不饱和多糖和非-血管生成 透明质酸的混合物，所述部分不饱和多糖被交联基团取代。所述混合物的交联是通过加入 自由基聚合引发剂（特别是苯乙酮（光引发剂））实现的。由于自由基聚合产生的大量降 解产物一旦形成就可能被限制在生成的水凝胶中，因此这个过程是非常不利的。
[0020] 本发明的目的是提供一种新的基于多糖的水凝胶，其对增加的降解具有良好的抵 抗性并且没有细胞毒性，对于美容外科、皮肤科、眼科、骨科用于软骨和骨关节重建、以及人 类和兽医再生医学的用途而言，其是可注射的并且是生物相容的。
【发明内容】
[0021] 本发明涉及共交联的磷酸化多糖水凝胶，基于（i)葡聚糖和（ii)透明质酸和/或 其盐，任选地官能化的透明质酸和/或其盐，在水凝胶中所述葡聚糖和所述透明质酸（和/ 或其盐，任选地官能化的透明质酸和/或其盐）通过磷酸二酯和/或聚磷酸二酯共价键结 合在一起。
[0022] 有利的是，透明质酸或其盐，为由三偏磷酸钠官能化的磷酰基透明质酸（和/或其 盐）。
[0023] 在本发明一个特定的实施方案中，三偏磷酸钠官能化的透明质酸（和/或其盐） 中磷酸盐的浓度介于0.0 lmEq/g至4mEq/g，更优选地介于0.1 mEq/g至2mEq/g。
[0024] 在本发明另一个实施方案中，水凝胶中磷酸盐的浓度介于0.1 mEq/g至3mEq/g，更 优选地介于〇· ImEq/g至2mEq/g。
[0025] 本发明还涉及一种制备基于葡聚糖和透明质酸的共交联的磷酸化多糖水凝胶和/ 或其盐（任选地官能化的）的方法，其中：
[0026] a)提供葡聚糖溶液；
[0027] b)通过向所述葡聚糖溶液中加入碱金属氢氧化物溶液（例如氢氧化钠），使得该 葡聚糖中的至少一个羟基被激活，从而得到活化的葡聚糖溶液；
[0028] c)向所述活化的葡聚糖溶液中加入三偏磷酸钠；
[0029] d)向步骤c)中获得的溶液中加入透明质酸和/或其盐，任选地官能化的透明质酸 和/或其盐。
[0030] 有利的是，同时进行该方法的步骤c)和d)，将三偏磷酸钠和透明质酸（和/或其 一种盐，任选地官能化的）同时添加至该方法步骤b)中获得的溶液中。
[0031] 有利的是，在18至25°C的温度下实施所述方法的步骤a)至d)。
[0032] 在该方法一个特定的实施方案中，步骤b)中加入的碱金属氢氧化物的浓度介于 0.1 M至IM之间，优选地介于0.1 M至0. 5M之间。
[0033] 在该方法另一个特定的实施方案中，该方法步骤d)中加入的透明质酸和/或其盐 为用三偏磷酸钠官能化的透明质酸。
[0034] 有利的是，以粉末的形式添加透明质酸和/或其盐（任选地官能化的）。
[0035] 本发明还涉及用于制备药物的本发明水凝胶，以及能够通过本发明方法制得的水 凝胶，将单独植入或与细胞（任选的干细胞）一起用于细胞疗法；或者将以湿形式用于局部 应用中；或者将用于运送活性分子和活性成分，以及更具体的生长因子，优选的生长因子选 自：成纤维细胞生长因子（FGFs)、血小板源性生长因子（PDGFs)、转化生长因子（TGFs)，血 管内皮生长因子（vEGF)，骨诱导生长因子（BMPs);或者将用于再生医学中，并且更具体地 用于人类和/或兽医再生医学。
[0036] 本发明的最终目的是本发明水凝胶用于骨传导和/或骨诱导的用途，即其用于骨 再生的用途。
【附图说明】
[0037] 图1至8阐明了本发明的某些方面。
[0038] 图1为红外光谱（IR)，其示出本发明方法（实施例1)中的反应混合物在25°C下 从同时添加透明质酸和三偏磷酸钠 TMP开始24小时内的红外曲线的变化（曲线a :添加后 22分钟；曲线b :添加后32分钟；曲线c :添加后42分钟；曲线d :添加后52分钟；曲线e : 添加后120分钟；曲线f :添加后24小时得到的凝胶）。X轴表示波数，以cm 1为单位；y轴 表示透过率（以％表示，无量纲）。
[0039] 图2的图表示出碱金属氢氧化物的浓度和三偏磷酸钠的浓度对葡聚糖交联的影 响。
[0040] 图3为根据本发明制