通过跨越血脑屏障的纳米颗粒递送治疗剂和显像剂的方法
【专利说明】通过跨越血脑屏障的纳米颗粒递送治疗剂和显像剂的方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2013年5月14日提交的美国临时专利申请61/822, 983的权益，该临 时申请的全部内容通过引用并入本文。
[0003] 政府权利
[0004] 本文公开的主题根据由美国国立卫生研究院（National Institutes of Health) 给予的拨款号R01NS0711121和由美国国家癌症研究所（National Cancer Institute)给 予的拨款号CA 151849在政府支持下做出。美国政府在本文公开的主题中拥有某些权利。
[0005] 背景
[0006] 在发达国家，中枢神经系统（central nervous system) (CNS)的慢性疾病是发病 和死亡的主要原因。在美国，单阿尔茨海默病（Alzheimer' s disease)就影响超过五百万 人，并且预计在2050年前会增长至超过一千三百万。在2012年，用于患有阿尔茨海默病的 人的护理总成本估计超过2000亿美元，并且预计在未来四十年内增长至1. 2万亿美元。此 外，在美国，虽然来自死亡的许多其他主要原因（诸如心脏疾病和中风）的死亡比例在过去 十年已发现显著减少，但是来自阿尔茨海默病的死亡比例已增加了 68%。类似的趋势，即高 经济成本和治疗进展相对缺乏两者，见于许多其他神经退行性疾病，包括亨廷顿氏舞蹈症 (Huntington' s disease)、帕金森病（Parkinson' s disease)和多发性硬化症（multiple sclerosis)发现了。
[0007] 治疗这些疾病缺乏进展的重要原因是由于血脑屏障（blood-brain barrier) (BBB)的存在。BBB是CNS实质和脉管系统之间的物理屏障，其在维持CNS内的稳态中起重 要作用。内皮细胞之间存在紧密连接，其抑制极性分子、大分子和细胞的细胞旁路扩散。这 迫使进入CNS的溶质运移主要发生于跨越单独的内皮细胞。虽然对于维持CNS稳态至关重 要，BBB对大多数溶质的不可透过性已证明对药物递送至CNS是巨大障碍。目前，98%的小 分子治疗剂和基本上100 %的大分子治疗剂，包括单克隆抗体、蛋白和基因疗法，都不跨越 BBB0
[0008] 在由溶质跨越BBB使用的内源性方法中，受体介导的转胞吞作用 (receptor-mediated transcytosis) (RMT)已经显示了用于药物递送的最大希望（见 Wiley等人，PNAS，110(21) :8662-667(2013)，其通过引用以其整体并入本文）。尽管在过去 的二十多年，对开发用于递送至脑的靶向治疗剂已存在很大兴趣，还尚未出现用于临床研 究的可行的候选物。
[0009] 概述
[0010] 本文描述了通过向受试者施用具有纳米颗粒核心和靶向剂的纳米颗粒将纳米颗 粒递送至受试者脑部的方法。多种靶向剂可用来促进所述的纳米颗粒的递送。例如，靶向 剂可包含对由脑内皮细胞表达的受体特异性的配体和将配体连接至纳米颗粒核心的外表 面的衔接物。另外，当在细胞之内时，衔接物可促进配体从纳米颗粒解离。
[0011] 所述的方法可使用多种纳米颗粒来进行。例如，纳米颗粒核心的表面可由以下制 成：阳离子粘液酸聚合物（cationic mucic acid polymers) (cMAP)、聚乳酸-羟基乙酸共聚 物（poly(lactic-co_glycolic acid) (PLGA)、壳聚糖、合成的聚合物诸如聚乙稀亚胺、金、 氧化铁或如由本领域技术人员所理解的其他类似材料。这些聚合物可与配体结合，所述配 体诸如转铁蛋白、对转铁蛋白受体特异性的抗体、特异性结合至转铁蛋白受体的多肽、胰岛 素、对胰岛素受体特异性的抗体、特异性结合至胰岛素受体的多肽、胰岛素样生长因子1、对 胰岛素样生长因子受体1特异性的抗体或特异性结合至胰岛素样生长因子受体1的多肽。 另外，纳米颗粒核心与配体可通过衔接物缀合，当在脑内皮细胞之内时所述衔接物促进配 体从纳米颗粒解离。在一些所述的实施方案中，衔接物可包含二硫键，当纳米颗粒在脑内皮 细胞之内时，所述二硫键可被还原导致配体从纳米颗粒解离。在一些所述的实施方案中，衔 接物可包含多肽，当纳米颗粒在脑内皮细胞之内时，所述多肽可被酶促裂解导致配体从纳 米颗粒解离。在一些所述的实施方案中，衔接物可包含可水解的化学键，当纳米颗粒在脑内 皮细胞之内时，所述可水解的化学键可在低PH下被破坏导致配体从纳米颗粒解离。在一些 所述的实施方案中，衔接物可包含具有以下PKa的化学键，当纳米颗粒在脑内皮细胞之内 时，所述化学键可在低PH下被破坏导致配体从纳米颗粒解离。
[0012] 提供的方法可以用利用各种衔接物的靶向剂来进行，所述衔接物用于将配体缀合 至纳米颗粒核心并且用于在脑内皮细胞之内后促进配体从纳米颗粒核心解离。在一些实施 方案中，所述的方法可使用这样的衔接物来进行，所述衔接物当未结合至纳米颗粒时具有 硝基苯硼酸，该硝基苯硼酸在所述衔接物结合至纳米颗粒核心时形成硝基苯硼酸酯，其中 衔接物和纳米颗粒核心的解偶联将在酸性PH(例如，约6. 8至约2.0)下是有利的。在另一 个实施方案中，靶向剂可包含二氨基缩酮（DAK)键连，在脑内皮细胞之内后，所述二氨基缩 酮（DAK)键连促进纳米颗粒与配体解离，其中衔接物和纳米颗粒核心的解偶联将在酸性pH 下是有利的。另外，所述的方法可使用含具有二硫键的衔接物的靶向剂来进行，所述具有二 硫键的衔接物可在脑内皮细胞中遇到的还原性条件下促进附连的配体从纳米颗粒解离。在 一些所述的实施方案中，靶向剂包含位于配体和介导与纳米颗粒核心缀合的区段之间的聚 乙二醇聚合物。
[0013] 为进行所述的方法，控制缀合至所述的纳米颗粒的靶向剂的数目可以是有利的。 在一些实施方案中，所述的纳米颗粒可具有多达1000个缀合的靶向剂。在其他实施方案 中，所述的纳米颗粒可具有多达500个缀合的靶向剂。可选择地，所述的纳米颗粒可具有少 至从约20个至50个缀合的靶向剂。在还另一个实施方案中，所述的纳米颗粒可具有少于 5个缀合的靶向剂。靶向剂的数目可依据被递送的纳米颗粒的种类、所递送的靶、用于靶向 颗粒的配体或许多其他因素进行调整。
[0014] 所述方法可用于通过在将纳米颗粒施用至受试者之前使所述纳米颗粒负载感兴 趣的治疗剂或显像剂，将治疗剂或显像剂递送至受试者的脑部。递送负载的纳米颗粒之后， 靶向剂将促进至感兴趣的靶细胞，诸如脑内皮细胞的递送。在由被靶细胞内化后，纳米颗粒 将从靶向剂解离。在脑内皮细胞的情况下，内化的纳米颗粒然后将被从细胞被排出进入脑 间质空间，在脑间质空间，颗粒将去稳定（destabilize)并分泌所负载的药剂物质，从而将 药剂物质递送到脑部或其他靶位置。在一些实施方案中，可进行所述的方法以将神经递质 神经递质诸如5-羟色胺或多巴胺递送至脑部，所述神经递质神经递质可被用来治疗神经 紊乱。用于治疗神经紊乱的其他物质还可经由所述的方法递送至脑部。自身可能不容易进 入脑部的显像剂也可使用所述的方法进行递送。此外，可使用所述的方法将一个或更多个 治疗剂、显像剂或治疗剂和显像剂两者的组合递送至受试者的脑部。
[0015] 本文还描述了用于产生靶向递送至脑部的纳米颗粒的试剂盒。例如，所述的试剂 盒可包含：组装纳米颗粒的材料和试剂，所述纳米颗粒具有阳离子粘液酸聚合物（cMP)外 表面或聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA)外表面，对由脑内皮细胞表达的受体特异性的靶 向剂，其中靶向剂包含被缀合至衔接物的配体，所述衔接物在脑内皮细胞内部时导致配体 从纳米颗粒解离；以及用于组装纳米颗粒的说明书。所述的试剂盒还可包含靶向脑内皮细 胞的配体，诸如转铁蛋白、对转铁蛋白受体特异性的抗体、特异性结合至转铁蛋白受体的多 肽、胰岛素、对胰岛素受体特异性的抗体、特异性结合至胰岛素受体的多肽、胰岛素样生长 因子1、对胰岛素样生长因子受体1特异性的抗体、特异性结合至胰岛素样生长因子受体1 的多肽。
[0016] 附图简述
[0017] 图1用于将治疗剂和/或显像剂递送至脑实质的总体设计图。纳米颗粒具有三个 基本的设计组分：（1)纳米颗粒核心；（2)间隔分子；以及（3)靶向剂。
[0018] 图2被革巴向的纳米颗粒（targeted nanoparticle)穿过血脑屏障（BBB)的运输， 该运输由靶向分子脱离纳米颗粒所促进。（1)血液中被靶向的纳米颗粒到达BBB腔表面。 (2)纳米颗粒的配体结合至其在BBB血液侧的受体上。（3)受体-纳米颗粒复合体的内化。 (4)纳米颗粒当其跨越BBB时经历的化学和/或物理变化导致配体从纳米颗粒剩余部分解 离。（5)未革巴向的纳米颗粒（untargeted nanoparticle)到达BBB的脑侧。（6)纳米颗粒 扩散至CNS。纳米颗粒的组分在图左侧的插入图例（inset key)中示出。图右侧括号内的 术语指出了参与此次序的相关分区。
[0019] 图 3 PEG偶联反应的MALDI-T0F 分析。NH2-PEG-SH(3. 4kDa)和 C00H-PEG-SH(2kDa) 反应在24小时时的MALDI光谱。峰A和B分别相应于反应物，C00H-PEG-SH和NH 2-PEG-SH。 峰C、D和E分别相应于如在方案1中概述的三个潜在产物，4kDa、5. 4kDa和6. 8kDa的聚合 物。
[0020] 图 4 二硫键裂解反应的 MALDI-T0F 分析。NH2-PEG-SH(3. 4kDa)和 C00H-PEG-SH(2kDa)反应在加入过量β-巯基乙醇（BME)后的MALDI光谱。峰A和B分别相 应于亲本聚合物C00H-PEG-SH和NH 2-PEG-SH。不存在来自由于过量BME所导致的巯基-二 硫键交换在PEG聚合物之间二硫键形成的产物的证据。
[0021] 图5包含二硫键的纳米颗粒与Neuro2A细胞的结合亲合力（binding avidity)。 示出了测量的数据点，正方形、菱形或三角形分别指示包含二硫键的PLGA-PEG-Tf纳米颗 粒（S-S)、用二硫苏糖醇处理后的包含二硫键的PLGA-PEG-Tf纳米颗粒（S-S+DTT)和甲氧基 封端的PLGA-PEG纳米颗粒（mPEG)。每个制剂的模型曲线都基于Langmuir结合等温线。
[0022] 图6小鼠脑切片中PLGA-mPEG纳米颗粒的共聚焦图。图A :488nm激发，图B :DAPI 信号，图C:图A和B的合并图。图D显示出了图C中合并图的放大图。实线箭头指示与细 胞核共定位的荧光。由于该现象见于非靶向颗粒，其被认为是正常组织背景荧光。虚线箭 头指示血管。
[0023] 图7小鼠脑切片中低-Tf PLAGA-PEG纳米颗粒的共聚焦图。图A示出了来自488nm 激发的荧光。图B示出了 DAPI信号。图C示出了图A和B的合并图。图D示出了图C中 的合并图的放大图。实线白色箭头指示与细胞核共定位的荧光。虚线白色箭头指示血管。 空心白色箭头指示在实质中与细胞核不相关的、确定为纳米颗粒信号的荧光。
[0024] 图8小鼠脑切片中高-Tf PLGA-PEG纳米颗粒的共聚焦图。图A示出了来自488nm 激发的荧光。图B示出了 DAPI信号。图C示出了图A和B的合并图。图D示出了图C中 合并图的放大图。实线白色箭头指示与细胞核共定位的荧光。虚线白色箭头指示血管。空 心白色箭头指示在实质中与胞核不相关的、确定为纳米颗粒信号的荧光。
[0025] 图9小鼠脑切片中高-Tf加上二硫化PLGA-PEG纳米颗粒的共聚焦图。图A示出 了来自488nm激发的荧光。图B示出了DAPI信号。图C示出了图A和B的合并图。图D 示出了图C中合并图的放大图。实线白色箭头指示与细胞核共定位的荧光。虚线白色箭头 指示血管。空心白色箭头指示在实质中与细胞核不相关的、确定为纳米颗粒信号的荧光。
[0026] 图10 DSS-DAK-PEG-OPSS与Tf缀合反应的MALDI-T0F追踪。未反应的Tf和数个 阶的PEG化的Tf被标记。
[0027] 图11 Tf-DAK-PEG-OPSS随时间在pH 5. 5缓冲液中的降解。示出了在5min⑷、 15min(B)、30min(C)、60min(D)、120min(E)、24 小时（F)孵育时间的粗混合物组成。
[0028] 图12 Tf-DAK-PEG-Au纳米颗粒与K562细胞在pH 5. 5 (正方形）或pH8 (菱形） 的缓冲液中孵育一个小时之后的结合。
[0029] 图13示出了三种不同的纳米颗粒随时间至涂覆bEnd. 3的Transwells1'的底部孔 (basal well)的迀移。菱形图反映显示了仅涂覆了 mPEG的金纳米颗粒的迀移，正方形图反 映显示了涂覆了不含可pH裂解的DAK衔接物的Tf-PEG的金纳米颗粒的迀移，三角图显示 了涂覆了含可pH裂解的DAK衔接物的Tf-PEG的金纳米颗粒的迀移。
[0030] 图14示出了来自在用具有酸可裂解的衔接物的包含Tf的金纳米颗粒处理之后小 鼠脑部的切片的图。实线箭头示出了血管中的NP，且空心（open)箭头示出了脑中的NP。 [0031 ] 图15组织培养Transwell龙系统的示意图。
[0032] 图16图A示出了不可裂解纳米颗粒的制备。图B示出了包含二硫键的纳米颗粒 的制备。每一种聚合物混合物在lOmg/mL的总PLGA浓度下在DMF中被制备，然后通过纳米 沉淀法形成纳米颗粒。
[0033] 说明性实施方案详述
[0034] 本文提供了将纳米颗粒递送至受试者脑部的方法，还描述了纳米颗粒以及可用于 连接递送所述的纳米颗粒或包含在纳米颗粒中的感兴趣的化合物的相关的组合物、方法和 试剂盒。
[0035] 当关于数字范围、截断值或具体值使用时，术语"约（about) "用来表示被列举的数 值可从所列值变化多达10%。因为本文所用的许多数值是实验确定的，本领域技术人员应 该理解，这样的确定可，并且经常情况下，将在不同的实验中变化。本文所用的值不应该被 认为是由于此固有变化而过度限制。术语"约"用来包含多达或等于10%的此类变化。
[0036] 如本文所用的术语"纳米颗粒（nanoparticle) "指纳米级尺寸的复合结构。特别 地，纳米颗粒通常是大小在从约1至约1000 nm范围内的颗粒，且尽管取决于纳米颗粒组成 不同的形态是可能的，但通常是球形。纳米颗粒接触该纳米颗粒的外部环境的部分通常被 确定为纳米颗粒的表面。在本文所述的纳米颗粒中，尺寸限制可限于两个维度，并因此本文 所述的纳米颗粒包括具有直径从约1至约1000 nm的复合结构，其中具体直径取决于根据实 验设计的纳米颗粒组成以及纳米颗粒的预期用途。例如，用于一些治疗应用中的纳米颗粒 通常具有约200nm或以下的尺寸，并且特别地，用于与癌症治疗相关的递送使用的纳米颗 粒通常具有从约1至IOOnm的直径。
[0037] 另外的可期望的纳米颗粒特性，诸如表面电荷和空间稳定，也可鉴于感兴趣的具 体应用而变化。技术人员在阅读本公开内容之后可理解颗粒的特性。纳米颗粒的尺寸和特 性可通过本领域已知的技术进行检测。检测颗粒尺寸的示例性技术包括但不限于：动态光 散射（DLS)和纳米颗粒追踪分析（NTA)以及多种显微术诸如透射电子显微术（TEM)和原子 力显微术（AFM)。检测颗粒形态的示例性技术包括但不限于TEM和AFM。检测纳米颗粒表 面电荷的示例性技术包括但不限于ζ电势法。适合于检测其他化学特性的另外的技术包 括 1H、11B和13C和19F NMR(核磁共振），UV/Vis (紫外/可见光）与红外/拉曼（Raman)光 谱和荧光光谱和显微术（当纳米颗粒与荧光标记结合使用时）以及由技术人员可确认的另 外的技术。
[0038] 如本文所用的"递送（deliver) "和"递送（delivery) "指影响化合物的空间位置 且特别是指定化合物的优选位置的活动。因此，从本公开内容的意义上说，递送化合物指影 响化合物在某一时间在某组条件下的定位和运动使得化合物在那些条件下的定位和运动 相对于化合物本来具有的定位和运动而变化的能力。
[0039] 如本文所用的术语"靶（target) "指包括器官、组织或其任何部分的感兴趣的生物 系统，且可包括体外或体内生物系统或其任何部分。
[0040] 如本文所用的术语"聚合物（polymer) "指包含通常由共价化学键连接的重复结 构单元的大分子。适合的聚合物可以是线形和/或支链的，并可采取均聚物或共聚物的形 式。如果使用共聚物，共聚物可以是无规共聚物或支化共聚物。示例性的聚合物包括水分散 性聚合物和特别是水溶性聚合物。例如，适合的聚合物包括，但不限于多糖、聚酯、聚酰胺、 聚醚、聚碳酸酯、聚丙烯酸酯，等等。对于治疗和/或药物用途和应用，聚合物应当具有低毒 性，且特别是无毒或无细胞毒性的。适合的聚合物包括具有约500, 000或以下分子量的聚 合物。特别地，适合的聚合物可具有约100, 〇〇〇和以下的分子量。
[0041] 如本文所用的术语"包含硼酸的聚合物（polymer containing a boronic acid) " 或"具有硼酸的衔接物（linker having a boronic acid)"以及类似物，指包含呈递用于结 合至包含多元醇的聚合物的羟基基团的至少一个硼酸基团。特别地，本文所述的纳米颗粒 的包含硼酸的聚合物包括在至少一个结构单元中包含包含碳-硼化学键的烷基或芳基取 代的