修饰的TGF-β寡核苷酸的制作方法
【专利说明】修饰的TGF-β寡核苷酸
[0001] 本发明涉及由TGF-β 2核酸序列的选定区域或TGF-β 1或TGF-β 3核酸序列的 选定区域的10-20个核苷酸组成的寡核苷酸，其包含修饰的核苷酸，如LNA、ENA、聚环氧烷、 2' -氟、2' -0-甲氧基和/或2' -0-甲基修饰的核苷酸。 技术背景
[0002] 转化生长因子MTGF-β)是一种在大多数细胞中控制增殖、细胞分化和其他功 能的蛋白质。它是一种类型的细胞因子，其在免疫、癌症、心脏病、糖尿病、马凡综合征、洛伊 斯-迪茨综合征、帕金森病和AIDS等中起作用。
[0003] TGF-β是一种分泌的蛋白，其以至少三种同种型的形式存在（TGF-β 1、TGF-β 2 和TGF-β 3)，由不同基因编码，但共有强序列和结构同源性。TGF-β在正常上皮细胞和 癌发生的早期以抗增殖因子的形式起作用。然而，在肿瘤发展的晚期，TGF-β通过包括 诱导上皮至间质瘤转变（EMT)的机制促进肿瘤，该转变是一种被认为参与肿瘤进展、侵染 和转移的过程（参见"Glycoproteomic analysis of two mouse mammary cell lines during transforming growth factor (TGF)-beta induced epithelial to mesenchymal transiti〇n(转化生长因子（TGF)-P诱导的上皮至间质瘤转变期间两种小鼠乳腺细胞系 的糖蛋白质组学分析）" 7th space, com. 2009-01-08.恢复：2009-01-29)。
[0004] 在正常（上皮）细胞中，TGF- β在GI期停止细胞周期（并停止细胞增殖）、诱导 分化或促进凋亡。当细胞转化为癌细胞时，TGF-β不再抑制细胞增殖，其通常是信号转导 途径中突变的结果，且癌细胞增殖。间质成纤维细胞的增殖也由TGF-β诱导。两种细胞都 提高其TGF-β生产。该TGF-β作用于周围间质细胞、免疫细胞、内皮、平滑肌细胞和肿瘤 微环境（参见 Pickupet 等，"The roles of TGF6 in the tumour microenvironment (肿 瘤微环境中 TGF6 的作用）"，Nature Reviews Cancer (2013)，13:788-799)。因而，其促进 血管生成，并通过抑制增殖和免疫细胞的激活导致免疫抑制。
[0005] TGF- β 1缺陷型小鼠死于心、肺和胃炎症，暗示TGF- β在抑制炎性细胞激活和增 殖方面至关重要。Smad3是TGF-β依赖性下游信号通路中的关键元件之一。Smad3缺陷 型小鼠由于T细胞激活和粘膜免疫受损而发生慢性粘膜感染，暗示TGF-β在这些过程中 的关键作用。对于癌症，某些癌细胞产生和分泌的TGF-β抑制浸润性免疫细胞的活性， 从而帮助肿瘤逃脱宿主免疫监控。该免疫抑制作用可以是另一种重要机制，TGF-β通过 该机制刺激晚期肿瘤的生长（参加 Blobe GC等，2000年5月，"Role of transforming growth factor beta in human disease(人疾病中转化生长因子 β 的作用）"，N.Engl. J. Med. 342 (18)，1350-1358)。TGF-β还将正常情况下使用炎性（免疫）反应攻击癌症的效 应T细胞转化为关闭炎性反应的调节性（抑制）T细胞。
[0006] 此外，TGF-β是胞外基质产生和沉积的最有力调控因子之一。其通过两种主要 机制刺激胞外基质的产生并影响其粘附性质。首先，TGF-β刺激成纤维细胞和其他细胞 产生胞外基质蛋白和细胞粘附蛋白，包括胶原、纤连蛋白和整联蛋白。其次，TGF-β减少 降解胞外基质的酶（包括胶原酶、肝素酶和间质溶解素）的产生，并增加抑制降解胞外基 质的酶的蛋白质（1型纤溶酶原激活物抑制剂和金属蛋白酶的组织抑制剂）的产生。这些 变化的净作用是增加胞外基质蛋白的产生并以细胞特异性方式提高或降低细胞的粘附性 质。TGF-β产生在许多癌细胞中增加，其通过提高细胞的蛋白水解活性和促进其结合细胞 粘连分子来提高细胞的侵染性（参见Blobe GC等，2000年5月，〃Role of transforming growth factor beta in human disease(人疾病中转化生长因子 β 的作用）〃，N.Engl. J. Med. 342(18)，1350-1358)。
[0007] 因此，能够分别影响TGF-β表达和活性的治疗剂至关重要，特别是用于预防和/ 或治疗TGF-β相关疾病时。例如，EP 1008649和EP 0695354公开了与TGF-βΙ和/或 TGF-β 2的mRNA杂交的寡核苷酸，且其适用于制造例如用于预防和/或治疗癌症的药物组 合物。这些寡核苷酸无一包含诸如LNA、ENA等的修饰。
[0008] 例如，WO 2003/85110、WO 2005/061710 和 WO 2008/138904 涉及可用于治疗癌症 的包含核苷酸修饰的寡核苷酸，其分别涉及抑制HIF-1A、Bcl-2和HER3。
[0009] 寡核苷酸选择的标准主要是寡核苷酸的长度、GC百分比、形成发夹结构的趋势、二 聚化和解链温度（Tm)。通常，优选高Tm(解链温度）。此外，这些寡核苷酸必须特异性针对 靶mRNA且不与非靶mRNA杂交以降低潜在的脱靶作用。
[0010] 因此，科学和医疗上非常需要降低或抑制TGF-β表达和/或活性的治疗剂。具体 而言，持续需要诸如反义寡核苷酸的寡核苷酸，其与TGF- β UTGF- β 2和/或TGF- β 3特异 性相互作用并因此降低或抑制其表达，或者特异性抑制TGF-β 1和TGF-β 2、或TGF-β 1和 TGF- β 3、或TGF- β 2和TGF- β 3的表达，而不导致任何（严重的）副作用。
【发明内容】
[0011] 本发明涉及的寡核苷酸由SEQ ID Ν0.1的TGF-02核酸序列（参见图2)或 SEQ ID NO. 335 的 TGF- β 1 核酸序列（参见图 12)或 SEQ ID NO. 336 的 TGF- β 3 核酸 序列（参见图25)的10-20个（优选12-18个）核苷酸组成，该寡核苷酸中的一个或 多个核苷酸是经修饰的。本发明的一些寡核苷酸对应于TGF-β 1、TGF-β 2和TGF-β 3， 或 TGF-β 1 和 TGF-β 2 或 TGF-β 1 和 TGF-β 3 或 TGF-β 2 和 TGF-β 3。优选的寡核苷 酸包含 SEQ ID NO. 2-149 (TGF-β 2)之一、SEQ ID No. 150-334 (TGF-β?)之一或 SEQ ID No. 337-402 (TGF- β 3)之一或由其组成，其示于表1。
[0012] 具体而言，本发明的寡核苷酸包含SEQ ID NO. 1的第1380-1510位核酸区域的 10-20个（优选12-18个）核苷酸或由其组成，该寡核苷酸中的一个或多个核苷酸是经修 饰的。这些寡核苷酸分别在降低和抑制TGF-β 2表达和活性方面高度有效。优选的寡核 苷酸包含或由以下序列组成：SEQ ID NO. 2 (如 ASPH36: GACCAGATGCAGGA)、SEQ ID NO. 3 (如 ASPH80:GCGACCGTGACCAGAT)、SEQIDN0·4(如ASPH98:GCGCGACCGTGACC)、SEQIDN0·5(如 ASPH111:AGCGCGACCGTGA)，或 SEQ ID Ν0·6(如 ASPH121 或 ASPH153:GACCGTGACCAGAT)、 SEQ ID NO·7(如 ASPH15:CTGCCCGCGGAT)、SEQ ID NO·8(如 ASPH17:TCTGCCCGCGGAT)、 SEQ ID Ν0·9(如 ASPH26 或 ASPH27:GGATCTGCCCGCGGA)、SEQ ID NO. 10(如 ASPH37:CTTGCTCAGGATCTGCC)、SEQ ID NO. 11(如 ASPH52 或 53:GCTCAGGATCTGCCCGCGGA)、 SEQIDN0·12(如ASPH112:GGATCGCCTCGAT)、SEQIDN0·13(如ASPH119:CCGCGGATCGCC)， 或 SEQ ID NO. 31(如 ASPH30:CGATCCTCTTGCGCAT)。
[0013] 在另一个实施方式中，本发明涉及一种寡核苷酸，其包含SEQ ID NO. 1的TGF-β 2 核酸序列的第2740-2810位核酸区域的10-20个（优选12-18个）核苷酸或由其组成，该 寡核苷酸中的一个或多个核苷酸是经修饰的。这些寡核苷酸分别在降低和抑制TGF-β 2 表达和活性方面高度有效。优选的寡核苷酸包含或由以下序列组成：SEQ ID NO. 57(如 ASPH65:TCTGAACTAGTACCGCC)、SEQ ID Ν0·73(如 ASPH82:AACTAGTACCGCCTTT)，或 SEQ ID NO. 103(如 ASPHl15:CTAGTACCGCCTT)。
[0014] 在另一个实施方式中，本发明涉及一种寡核苷酸，其包含SEQ ID NO. 1的 TGF-β 2核酸序列的第1660-1680位核酸区域的10-20个（优选12-18个）核苷酸或 由其组成，该寡核苷酸中的一个或多个核苷酸是经修饰的。这些寡核苷酸分别在降低 和抑制TGF-β 1和/或TGF-β 2表达和活性方面高度有效。优选的寡核苷酸包含或 由以下序列组成：SEQ ID NO. 14(如 ASHPOl 或 ASPH02:ACCTCCTTGGCGTAGTA)、SEQ ID NO. 15(如 ASPH03 或 ASPH04:CCTCCTTGGCGTAGTA)、SEQ ID NO. 16(如 ASPH05、ASPH06 或 ASPH07:CTCCTTGGCGTAGTA)，或 SEQ ID NO. 17(如 ASPH08:TCCTTGGCGTAGTA)。
[0015] 在另一个实施方式中，本发明涉及一种寡核苷酸，其包含SEQ ID NO. 1的TGF-β 2 核酸序列的第2390-2410位核酸区域的10-20个（优选12-18个，最优选13个）核苷酸或 由其组成，该寡核苷酸中的一个或多个核苷酸是经修饰的。这些寡核苷酸分别在降低和抑 制TGF-β UTGF-β 2和/或TGF-β 3表达和活性方面高度有效。优选的寡核苷酸包含或由 以下序列组成：SEQ ID NO. 18 (如 ASPH9 或 ASPH10:CAGAAGTTGGCAT)。
[0016] 在另一个实施方式中，本发明涉及一种寡核苷酸，其包含SEQ ID NO. 1的TGF-β 2 核酸序列的10-20个（优选12-18个）核苷酸或由其组成，该寡核苷酸中的一个或多个核 苷酸是经修饰的。这些寡核苷酸分别在降低和抑制TGF- β 1、TGF- β 2和/或TGF- β 3 (且 最优选TGF-β 2)表达和活性方面高度有效。优选的寡核苷酸包含或由以下序列之一组成： SEQ ID NO. 19-56、58-72、74-102、104-138(例如 ASHPl 1-ASPH14、ASPH16、ASPH18-ASPH25、 ASPH28-ASPH35、ASPH38-ASPH51、ASPH60-64、ASPH66-ASPH79、ASPH81、ASPH83-ASPH97、 ASPH99-ASPH110、ASPH113、ASPH114、ASPH116-118、ASPH120、ASPH122-ASPH152、 ASPH154-ASPH183,或 T-LNA(SEQ ID N0:144))。
[0017] 本发明中优选的寡核苷酸分别是ASPHO1、ASPH03、ASPH05、ASPHl7、ASPH22、 ASPH26、ASPH27、ASPH35、ASPH36、ASPH37、ASPH45、ASPH47、ASPH48、ASPH65、ASPH69、ASPH71、 ASPH80、ASPH82、ASPH98、ASPH105、ASPH115、ASPH190、ASPH191、ASPH192 和 ASPH193。
[0018] 本发明中其他优选的寡核苷酸是表1所示的ASPH1000至ASPH1132,其优选抑制 TGFf3 I mRNA的表达和/或活性。该组中优选的寡核苷酸分别是例如ASPH1047、ASPH1051、 ASPH1059、ASPHl 106、ASPHl 139、ASPHl 150、ASPHl 162、ASPHl 163、ASPHl 175、ASPHl 178 和 ASPHl181〇
[0019] 在替代性实施方式中，寡核苷酸优选抑制TGF0 3 mRNA的表达和/或活性。这 类寡核苷酸分别是例如 ASPH2000、ASPH2001、ASPH2002、ASPH2003、ASPH2004、ASPH2005、 ASPH2006、ASPH2007、ASPH2008、ASPH2009、ASPH2010、ASPH2011、ASPH2012、ASPH2013、 ASPH2014、ASPH2015、ASPH2016、ASPH2017、ASPH2018、ASPH2019、ASPH2020、ASPH2021、 ASPH2022、ASPH2023、ASPH2024、ASPH2025、ASPH2026、ASPH2027、ASPH2028、ASPH2029、 ASPH2030、ASPH2031、ASPH2032、ASPH2033、ASPH2034、ASPH2035、ASPH2036、ASPH2037、 ASPH2038、ASPH2039、ASPH2040、ASPH2041、ASPH2042、ASPH2043、ASPH2044、ASPH2045、 ASPH2046、ASPH2047、ASPH2048、ASPH2049、ASPH2050、ASPH2051、ASPH2052、ASPH2053、 ASPH2054、ASPH2055、ASPH2056、ASPH2057、ASPH2058、ASPH2059、ASPH2060、ASPH2061、 ASPH2062、ASPH2063、ASPH2064、ASPH2065 和 ASPH2066。
[0020] 本发明的寡核苷酸显示对TGF- β 1、TGF- β 2或TGF- β 3,或TGF- β 1和TGF- β 2 的意料之外的强且特异性抑制。或者，本发明的寡核苷酸显示对TGF-β 1和TGF-β 3或 TGF- β 1和TGF- β 2或TGF- β 2和TGF- β 3,并在另一情况下显示对TGF- β I、TGF- β 2和 TGF-β 3的强且特异性抑制。
[0021] 本发明的核苷酸中的一个或多个核苷酸的修饰选自LNA、ΕΝΑ、聚环氧烷（如三甘 醇（TEG))、2'_氟、2'-0-甲氧基和2'-0-甲基。这些修饰优选位于寡核苷酸的5'和/或 3'端。包含这类修饰的核苷酸的寡核苷酸是修饰的寡核苷酸。
[0022] 修饰的核苷酸是排列为例如一列（彼此直接紧邻）或不同的模式（此时一个或多 个未修饰的核苷酸在一个修饰的核苷酸后）。例如，寡核苷酸以一个或多个修饰的核苷酸起 始，随后是一个或多个（如一个、两个、三个或四个）未修饰的或未锁定的（unlocked)核苷 酸，随后再是一个或多个修饰的核苷酸。在一个实施方式中，该寡核苷酸的两端都包含相同 模式的修饰的和未修饰的或未锁定的核苷酸。在另一个实施方式中，3'和5'端的修饰模式 不同，包括一端不包含修饰的核苷酸。优选地，修饰的寡核苷酸包含连续8或9个未锁定的 核苷酸。
[0023] 或者，该寡核苷酸中任何其他位置的核苷酸，或者该寡核苷酸的5'和/或3' 端处和该寡核苷酸中的任何其他位置的至少一个核苷酸是经修饰的。例如，ASPH1071、 ASPHl100、ASPHl109、ASPH 1110、ASPH1111、ASPH1115、ASPHl126、ASPHl127 和 ASPHl128 属 于一组TGF-β寡核苷酸，例如TGF-β 1寡核苷酸，其包含处于不同模式（例如由未锁定的 核苷酸隔开彼此）中的修饰的核苷酸（如LNA、ENA等）。这些寡核苷酸包含一种类型的修 饰，或一种或多种不同的修饰。任选地，寡核苷酸的两个连续核苷酸（修饰或未修饰的）之 间的至少一个磷酸连接是硫代磷酸酯或甲基膦酸酯。在优选的实施方式中，本发明的寡核 苷酸是硫代磷酸酯。
[0024] 此外，本发明涉及TGF-β反义寡核苷酸，其与超过一种TGF-β同种型相互作用并 抑制其表达，即使在寡核苷酸与TGF- β I、TGF- β 2和/或TGF- β 3序列非100 %互补的情况 下也是如此。这类反义寡核苷酸分别是例如ASPH1024、ASPH1096、ASPH1131和ASPH1132。这 些寡核苷酸优选与不同物种（如人和小鼠）的TGF-β序列相互作用，例如分别是ASPH1131 和 ASPHl132。
[0025] 不同实施方式的所有寡核苷酸均用于预防和/或治疗以下疾病的方法：恶性或良 性肿瘤、免疫疾病、纤维化（如特发性肺纤维化、肾脏纤维化、肾纤维化）、硬化（肝硬化）、 硬皮病或相关皮肤疾病、眼疾病（如青光眼或后囊膜混浊（PCO) )、CNS疾病、脱发等。
【附图说明】
[0026] 图1显示核苷酸修饰的示例。
[0027] 图 2 显示人 TGF- β 2 mRNA 的核酸序列（ΝΜ_003238· 3)。
[0028] 图3a)至3c)显示人Α172神经胶质瘤细胞中TGF- β 1和TGF- β 2 mRNA表达的抑 制。以IOnM的剂量使用不同的修饰的寡核苷酸转染A172细胞（在转染试剂存在的情况 下），并在转染后24小时测量TGF- β 1 (白色柱）和TGF- β 2 (黑色柱）mRNA表达的抑制。 图3&)是以下修饰的寡核苷酸的结果45?!101、45?!102、45?!103、45?!104、45?!105、45?!106、 ASPH07、ASPH08、ASPH09、ASPH10、ASPH11、ASPH12、ASPH13、ASPH14、ASPH15、ASPH16、ASPH17、 ASPH18、ASPH19、ASPH20、ASPH21、ASPH22、ASPH24、ASPH25、ASPH26、ASPH27、ASPH29、ASPH30、 ASPH31、ASPH32、ASPH33、ASPH34、ASPH35、ASPH36、ASPH37、ASPH38、ASPH39、ASPH40、ASPH41、 ASPH