一种固液相结合制备西那普肽的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及多肽合成领域，特别涉及一种固液相结合制备西那普肽的方法。
【背景技术】
[0002] 新生儿呼吸窘迫综合征（RDS)是指新生儿出生后不久即出现进行性呼吸困难和 呼吸衰竭等症状，主要是由于缺乏肺泡表面活性物质所引起，导致肺泡进行性萎陷，患儿于 生后4-12小时内出现进行性呼吸困难、呻吟、发绀、吸气三凹征，严重者发生呼吸衰竭。发 病率与胎龄有关，胎龄越小，发病率越高，体重越轻，病死率越高。
[0003] 2012 年 3 月 6 日，Discovery Laboratories 公司的气管内悬液 Surfaxin (Lucinactant， 芦西纳坦）获得美国食品药品管理局（FDA)批准，用于治疗早产儿呼吸窘迫综合征。 Surfaxin是在西那普肽的基础上根据天然人肺表面活性剂的特点设计而成的产品，用于模 拟人肺表面活化蛋白B(SP-B)。
[0004] 西那普肽，英文名称为Sinapultide，分子量2469. 40,是一种人工设计的含有21 个氨基酸的多肽分子，其结构如下：
[0006] 目前国内关于西那普肽的合成方法主要有基因重组法和化学法。其中美国专利 US5260273采用基因重组技术合成西那普肽，但该方法操作繁琐，且技术要求及生产成本极 高，不利于进行工业化大规模生产，最重要的是，一旦重组基因 DNA分子链上的核苷酸发生 突变，则会造成肽链上相应的氨基酸突变，降低了药品的纯度和使用安全性。
[0007] 中国专利CN 102850440 A是国内首个有关西那普肽合成方法的专 利，采用了片段合成的方法。该方法首先通过固相合成的方法合成片段肽树脂 Fmoc-Lys (Boc) -Leu-Leu-Leu-Leu-树脂，然后再逐步偶联以固相法制得的中间体Fmo C-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-OH,制得 KLLLLKLLLLKLLLLKLLLL 肽树脂，裂解后得西 那普肽类似物，该专利采用固相法制备多肽片段，需要耗用大量昂贵的载体树脂，生产 成本较高，并且在合成片段Fmoc-Ly s (Boc) -Leu-Leu-Leu-Leu-OH过程中，容易产生杂 质Fmoc-Lys-Leu-Leu-Leu-Leu-ΟΗ，进而导致终产品中含有Lys侧链氨基偶联上片段 H-Lys-Leu-Leu-Leu-Leu-OH 的杂质。
[0008] 中国专利CN 104098656 A采用Fmoc固相合成法，依次偶联每一位保护氨基酸，获 得保护21肽树脂，经裂解反应制得西那普肽，产率为47. 9 %。此方法生产周期较长，经历多 步接肽反应，粗肽纯度较低，导致总收率较低，生产成本高。
[0009] 中国专利CN 104817631 A介绍了 一种首先通过Fmoc固相合成法合 成Fmoc-Lys (Boc)-树脂，然后交替偶联保护片段Fmoc- (Leu) 4-OH与保护氨基酸 Fmoc-Lys (Boc) -OH，制得西那普肽肽树脂，最后经裂解反应制得西那普肽的方法。此方法仍 需经历多步接肽反应，粗品纯度较低，产率在52. 3% -57. 1 %之间，生产周期较长，生产成 本高。
[0010] 综上所述，目前报道的西那普肽合成方法中，均存在生产周期较长，生产成本高的 问题，不利于放大生产，产率较低的问题。
【发明内容】
[0011] 为解决上述西那普肽合成过程中存在的问题，本发明提供一种固液相结合制备西 那普肽的方法：首先采用液相法制备多肽片段I :
[0012] Fmoc-Leu-Leu-Leu-Leu_Lys(Boc)-〇H，然后采用Fmoc固相合成法向载体树脂上 依次偶联四个多肽片段I，最后偶联保护氨基酸Lys，经裂解反应后制得西那普肽。采用本 方法制备西那普肽仅需经过五步接肽反应，生产周期短，粗肽纯度高，收率高，同时大大降 低了生产成本，适宜进行工业化生产。
[0013] 为实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0014] -种固液相结合制备西那普肽的方法，包括如下步骤：
[0015] (a)制备多肽片段 I :Fmoc-Leu-Leu-Leu-Leu_Lys (Boc)-OH ;
[0016] (b)采用Fmoc固相合成法向载体树脂上依次偶联步骤（a)中的多肽片段I依次偶 联4次后，然后偶联保护氨基酸Lys，制备西那普肽肽树脂；
[0017] (C)西那普肽肽树脂经裂解反应制备西那普肽粗肽；
[0018] (d)西那普肽粗肽经纯化过程制备西那普肽精肽。
[0019] 其中，步骤（a)中，多肽片段I的制备过程为：
[0020] (1)合成Boc-Leu-OSu :Boc-Leu-〇H与HOSu在有机溶剂中，以DCC为活化剂，反应 制备 Boc-Leu-OSu ;其中 Boc-Leu-OH 和 HOSu 的摩尔比为 I: I. 0 ~L 2 ;Boc-Leu-〇H 和 DCC 的摩尔比为1:1. 0~1. 2 ;
[0021] (2)合成H-Leu-Leu-OH :H_Leu-〇H和Boc-Leu-OSu在碳酸钠溶液中反应，制备 Boc-Leu-Leu-OH，然后经TFA处理，制备H-Leu-Leu-OH ;其中H-Leu-OH和碳酸钠的摩尔比 为 I : I. 0 ~2. 0 ;H-Leu-〇H 和 Boc-Leu-OSu 的摩尔比为 I: I. 1 ~L 5 ;
[0022] (3)合成Fmoc-Leu-OSu :Fmoc-Leu-〇H与HOSu在有机溶剂中，以DCC为活化剂，反 应制备 Fmoc-Leu-OSu ;其中 Fmoc-Leu-OH 和 HOSu 的摩尔比为 I: L 0 ~L 2 ;Fmoc_Leu-〇H 和DCC的摩尔比为1:1. 0~L 2 ;
[0023] (4)Fmoc-Leu-Leu-OH 的制备：H_Leu-〇H 和 Fmoc-Leu-OSu 在碳酸钠溶液中反应， 制备Fmoc-Leu-Leu-OH ;其中H-Leu-OH和碳酸钠的摩尔比为I :1. 0~2. 0 ;H-Leu-〇H和 Fmoc-Leu-OSu 的摩尔比为 I: L 1 ~L 5 ;
[0024] (5) Fmoc-Leu-Leu-OSu 的制备：Fmoc-Leu-Leu-〇H 与 HOSu 在有机溶剂中，以 DCC 为 活化剂，反应制备Fmoc-Leu-Leu-OSu ;其中Fmoc-Leu-Leu-OH和HOSu的摩尔比为I: L 0~ I. 2 ;Fmoc-Leu-Leu-〇H 和 DCC 的摩尔比为 I: I. 0 ~1. 2 ;
[0025] (6) Fmoc-Leu-Leu-Leu-Leu-OH 的制备：H-Leu_Leu-〇H 和 Fmoc-Leu-Leu-OSu 在碳 酸钠溶液中反应，制备Fmoc-Leu-Leu-Leu-Leu-OH ;其中H-Leu-Leu-OH和碳酸钠的摩尔比 为 I :1. O ~2· O ;H-Leu-Leu-〇H 和 Fmoc-Leu-Leu-OSu 的摩尔比为 I: I. 1 ~I. 5 ;
[0026] (7)Fmoc-Leu-Leu-Leu-Leu-OSu 的制备：Fmoc-Leu-Leu-Leu_Leu-〇H 与 HOSu在有机溶剂中，以DCC为活化剂反应制备Fmoc-Leu-Leu-Leu-Leu-OSu ;其中 Fmoc-Leu-Leu-Leu-Leu-OH 和 HOSu 的摩尔比为 I: I. 0 ~I. 2 ;Fmoc-Leu-Leu-Leu_Leu-〇H 和 DCC的摩尔比为1:1. 0~1. 2 ;
[0027] (8) Fmoc-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys (Boc)-OH 的制备：H_Lys (Boc)-OH 和 Fmoc-Leu-Leu-Leu-Leu-OSu 在碳酸钠溶液中反应，制备 Fmoc-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys ( Boc) -OH ;其中 H-Lys (Boc) -OH 和碳酸钠的摩尔比为 I : I. 0 ~2. 0 ;H-Lys (Boc) -OH 和 Fmoc-Leu-Leu-Leu-Leu-OSu 的摩尔比为 I: I. 1 ~1. 5〇
[0028] 优选的，步骤（a)中，多肽片段I的制备过程为：
[0029] Boc-Leu-OSu的制备：将Boc-Leu-OH和HOSu溶于有机溶剂中，然后向其中滴加 DCC的有机溶剂溶液，搅拌反应，TLC监测反应终点。反应结束后抽滤，浓缩反应液，向浓缩 液中加入5~6倍体积的石油醚，析出白色固体，抽滤，滤饼以乙酸乙酯重新溶解至浓缩后 体积，加入5~6彳首体积石油酿，析晶，抽滤，真空干燥滤饼，得Boc_Leu-〇Su。Boc-Leu-OH 和HOSu的摩尔比为1:1. 0~L 2 ;Boc-Leu-〇H和DCC的摩尔比为1:1. 0~L 2。
[0030] H-Leu-Leu-OH的制备：将H-Leu-OH和碳酸钠溶于水中，加入Boc-Leu-OSu的有 机溶剂溶液，搅拌反应，TLC监测反应终点，反应结束后，过滤，向滤液中加入10%柠檬酸 水溶液调节溶液PH值至2~3,乙酸乙酯萃取，浓缩后加入5~6倍体积石油醚析晶得 Boc-Leu-Leu-OH。Boc-Leu-Leu-OH 经 TFA 处理后，冷乙酿中沉降析出，即得 H-Leu-Leu-OH。 H-Leu-OH和碳酸钠的摩尔比为1 :1~2 ;H-Leu-〇H和Boc-Leu-OSu的摩尔比为1:1. 1~ 1. 5〇
[0031] Fmoc-Leu-OSu的制备：将Fmoc-Leu-OH和HOSu溶于有机溶剂中，然后向其中