抗afb1的纳米抗体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及单域重链抗体技术（又称纳米抗体技术），以及基因工程抗体技术，特 别是针对黄曲霉毒素的单域重链抗体或多肽。 技术背景
[0002] 黄曲霉毒素（AfIatoxin)是由黄曲霉（Aspergillus fIavus)、寄生曲霉 (Aspergillus parasiticus)、集蜂曲霉（Aspergillus nomius)和溜曲霉（Aspergillus tamarii)等真菌产生的次级代谢产物，具有强致癌性和强免疫抑制性。黄曲霉毒素是一类 化学结构类似的二呋喃香豆素衍生物，主要包括黄曲霉毒素 B1 (AFB1)、B2(AFB2)、G1 (AFG1)、 G2(AFG1)和M1 (AFM1)等。在已发现的黄曲霉毒素中，黄曲霉毒素 B1的毒性最强，被世界卫生 组织的癌症研究机构划定为I类致癌物。产毒真菌菌株广泛存在于自然界中，粮食油料等 农产品在生产、加工以及储藏等过程中均可能受到污染，导致黄曲霉毒素超标。我国是黄曲 霉毒素污染情况较为严重的地区。因此，开发稳定、快速、高灵敏、高通量的黄曲霉毒素检测 方法，对于保障我国食品安全、减少由此带来的损失具有重要意义。
[0003] 现有的黄曲霉毒素检测方法主要有免疫分析法、仪器分析法以及薄层层析法。其 中免疫分析法可避免其它两类方法存在的一些缺陷，具有灵敏度高、成本低以及可现场检 测等优点。免疫分析法的原理是基于抗原抗体的特异性识别，抗体的性能是免疫分析方法 灵敏度、准确度等指标的决定性因素。因此获得针对黄曲霉毒素的抗体是建立相关免疫学 检测技术的前提和关键。
[0004] 单域重链抗体（又称纳米抗体）是由羊驼重链抗体的可变区组成，又称为纳米抗 体，具有耐酸碱、耐高温以及易于生产等特性。这些特性对于黄曲霉毒素的低成本、可重复 使用的免疫学检测方法有重要的实用价值。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供针对黄曲霉毒素的单域重链抗体，可以被用于制备检测黄曲 霉毒素的试剂和工具。
[0006] 本发明提供一个针对黄曲霉毒素的单域重链抗体（即本发明抗AFBl的纳 米抗体，下同），具有SEQ ID N0.:1所示的氨基酸序列。其氨基酸序列的頂GT编 号和结构域的划分包括四个框架区（Framework region，FR)和三个互补决定区 (Complementarity-determining region, CDR)〇
[0007] 本发明提供一个核酸分子，其特征是编码SEQ ID NO. :1，通过遗传密码子可以随 时获得该核酸分子的具体序列。
[0008] 本发明还提供一个核酸分子，其特征是编码SEQ ID NO. : 1部分结构域，通过遗传 密码子可以随时获得该核酸分子的具体序列。可以为SEQ ID NO. :2核酸分子。
[0009] 本发明所提供的核苷酸序列或者至少部分序列可以通过合适的表达系统进行表 达以得到相应的蛋白质或多肽。这些表达系统包括细菌，酵母菌，丝状真菌，动物细胞，昆虫 细胞，植物细胞，或无细胞表达系统。
[0010] 本发明还提供一种载体，包含所述核酸序列。由于遗传密码子具有简并性，该核酸 序列可以根据不同的应用目的而不同。
[0011] 本发明还提供一种宿主细胞，包括所述蛋白质或表达载体。
[0012] 本发明还提供一种检测黄曲霉毒素的方法，含有本发明所述针对黄曲霉毒素 的单域重链抗体。基于本发明提供的针对黄曲霉毒素的单域重链抗体与黄曲霉毒素特 异性结合的能力，建立黄曲霉毒素的检测方法。其中，优选的方法包括酶连免疫吸附法 (Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，焚光免疫法（Fluoroimmunoassay，FIA)， 免疫芯片法，亲和层析法和免疫层析法等。
[0013] 本发明所提供的氨基酸序列可以作为前体，通过随机或定点突变技术进行改造， 能够获得性质（水溶性、稳定性、亲和力以及特异性等）更好的突变体。
[0014] 本发明还涉及前述针对黄曲霉毒素的单域重链抗体在免疫检测、黄曲霉毒素富集 以及纯化中的应用。这些免疫检测指的是非疾病诊断治疗目的的免疫检测。
[0015] 本发明所叙述的一些术语具有如下含义：
[0016] 结构域：蛋白质三级结构的基本结构单位，通常具有一定的功能。
[0017] IMGT 编号：IMGT 数据库（The International ImMunoGeneTics Datbase)中的一 种已经标准化的抗体氨基酸序列编号方法。具体编号方法可以参考文献（Ehrenman，F.， Q. Kaas,et. al. (2010). IMGT/3D structure-DB and IMGT/DomainGapAlign ：a databaseand a tool for immunoglobulins or antibodies，T cell receptors，MHC，IgSF and MhcSF. Nucleic Acids Res38(Database issue):D301-307. Lefranc, M. P. , C. Pommie, et al. (2003). IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Igsuperfamily V-Iike domains Dev comp Tmmunol 27 (I) : 55-77.)中的描 述。
[0018] 密码子（codon):又称为三连体密码子（triplet code)，指对应于某种氨基酸的 核苷酸三联体。在转译过程中决定该种氨基酸插入生长中多肽链的位置。
【具体实施方式】
[0019] 下面通过单域重链抗体（多肽）的制备、分析及应用，对本发明做进一步说明，这 些具体实施例不应以任何方式被解释为限制本发明的应用范围。
[0020] 实施例1 :
[0021] 抗黄曲霉毒素单域重链抗体（即针对黄曲霉毒素的单域重链抗体）免疫文库的构 建
[0022] 将黄曲霉毒素队与匙孔血蓝蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH)共价偶联， 得到黄曲霉毒素人工抗原AFB1-KLH,取300 μ g AFB1-KLH与弗氏完全佐剂乳化后，对羊驼 (Lama pacos)进行皮下多点注射免疫。加强免疫采用150 μ g AFB1-KLH与弗氏不完全佐剂 乳化，间隔2周进行，每次免疫7天后静脉取血，采用间接ELISA法测定血清效价，选择血清 效价最高的样品分离淋巴细胞，提取RNA。
[0023] RNA的提取参照TAKARA公司RNAiso试剂说明书进行。以RNA为模板，oligo dT 为引物，参照TAKARA公司反转录酶说明书合成cDNA第一链。
[0024] 采用PrimeSTAR高保真DNA聚合酶，经巢式PCR获得重链抗体的可变区编码基因 (采用的引物见表1)。第一轮PCR分别以引物AlpVh-LD和CH2-R扩增cDNA，反应条件为， 98Γ，10s，55Γ，20s，72Γ，lmin，20 个循环，98Γ，10s，68Γ，lmin，72Γ延伸 lOmin。
[0025] 将第一轮PCR产物用1. 2 %的琼脂糖凝胶电泳，回收600bp~750bp的DNA片 段，作为第二轮PCR的模板，分别用引物AlpVh-SfiI和AlpVHHRl-Notl，AlpVh-SfiI和 八1口￥冊1?2-如《，进行扩增，反应条件为，98°(：，1〇8,50°(：，2〇8,72°(：，4〇8,5个循环，98°(：， 108,68°(：，408,30个循环，72°(：延伸101^11。经0嫩片段回收试剂盒回收、定量，于-20°(：保 存备用。将噬菌粒pHENl和PCR扩增产物分别用Sfi I、Not I双酶切，经琼脂糖凝胶回收、 定量后，以1 : 3摩尔比，在16°C，过夜连接。
[0026] 表1文库构建及鉴定所用的引物
[0028] 注：下划线表示限制性内切酶识别序列
[0029] 连接产物经乙醇沉淀后，溶于10 μ L无菌水，分十次进行电穿孔转化大肠杆菌 TGl。取IOyL电击、培养后的菌液倍比稀释，涂布氨苄青霉素2 X YT培养板，37°C，倒置 培养12~16h，采用引物M13-R和pHEN-R进行菌落PCR，计算库容；其余部分全部涂布于 24〇1^24〇11氨苄青霉素2\￥1'培养板，37°(：，倒置培养12~1611。用1〇1^，2\￥1'培养基将 培养板上的菌苔刮洗后，加入终浓度15~30%甘油，分装，-80°C保存备用。
[0030] 根据计算的库容量结果，接种10倍库容量的活细胞于20mL的2XYT(含2%葡萄 糖，lOOyg/mL氨苄青霉素），30°C，220r/min培养至0D600达0. 5,按感染复数20 : 1加入 辅助噬菌体，37°(：，22(^/11^11，6〇1^11。将培养物离心，用5〇1^的2\￥1'(含10(^8/1^氨苄 青霉素和50 μ g/mL卡那霉素）重悬沉淀，30°C，220r/min过夜培养后，3000g离心取上清， 加入5XPEG/NaCl溶液，冰上放置Ih或4°C过夜，12000rpm离心30min，重悬沉淀于含10% 甘油的磷酸缓冲液（PBS，0.01M，pH 7. 4)，即得到抗黄曲霉毒素单域重链抗体免疫文库，取 10 μ L测定滴度，其余分装于-80°C保存备用。
[0031] 实施例2:
[0032]