一株产纤溶酶的海洋放线菌株、用途以及由其制备的纤溶酶及纤溶酶的应用

文档序号:9628002阅读:756来源:国知局
一株产纤溶酶的海洋放线菌株、用途以及由其制备的纤溶酶及纤溶酶的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株海洋放线菌及其应用,属于生物工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 血栓性疾病严重危害人类健康,其致死率和死亡率较高。目前临床应用的溶栓剂 存在一定缺陷,有的毒副作用强,有的半衰期短,价格昂贵等,比如蝮蛇抗栓酶和蚓激酶来 源紧缺、价格昂贵、不易保存,尿激酶(UK)具有出血倾向,链激酶(SK)和葡激酶(SaK)具有 抗原性。因而,开发治疗血栓性疾病的药物成为了当前国内外医学研究的重点和热点,相关 药物具有巨大的发展潜力和应用前景。
[0003] 海洋蕴藏着丰富的微生物资源,由于海洋的高盐、低温、低营养等特殊环境,海洋 微生物可产生大量化学结构新颖、甚至有特殊作用的生物活性物质,具有极高的应用价值。 放线菌是海洋微生物中的一个重要组成部分,海洋放线菌活性物质的研究是海洋微生物产 物中值得关注的一个热点。

【发明内容】

[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种可产生纤溶酶的海洋放线菌菌株、其制备方 法和用途以及尤其制备的纤溶酶及纤溶酶的用途。
[0005] 为解决上述技术问题,本发明所采取的技术方案是:
[0006] -种海洋放线菌MY0504,该菌于2015年3月25日于中国微生物菌株保藏管理委 员会普通微生物中心进行了保藏,其保藏编号为CGMCC No. 10664。
[0007] 海洋放线菌MY0504对多种抗生素敏感;小鼠急毒实验安全无毒性,该菌株对多种 抗生素敏感。
[0008] 进一步的,本发明所述的海洋放线菌MY0504在制备纤溶酶中的用途。
[0009] 进一步的,所述纤溶酶的制备方法,如下:发酵菌接入LB海水培养基后进行发酵 培养,发酵液的提取纯化获得纤溶酶;
[0010] 所述的发酵菌为海洋放线菌MY0504;所述的LB海水培养基的组成为:蛋白胨 IOg · L \酵母浸粉5g· L^pH 7.0-7. 2,余量的海水或模拟海水。三角瓶培养基装量 100mL/500mL,25°C培养3-4天,摇床转速140r/min,以尿激酶为标准对照,纤溶酶发酵水平 约 500U/mL。
[0011] 进一步的,通过上述制备方法制备的纤溶酶,具有下述特性:
[0012] 其分子量约15KD ;该纤溶酶具有分子量小,具有纤维蛋白特异性强的功能。
[0013] 进一步的,所述的纤溶酶可用于制备溶栓剂,并用于治疗血栓性疾病。
[0014] 采用上述技术方案所产生的有益效果在于:
[0015] 1、本发明的链霉菌属放线菌MY0504通过液体深层发酵培养,胞外产物含有纤溶 性蛋白酶,活性达到500U/mL,可以用于血栓病的治疗应用。
[0016] 2、本发明的链霉菌属放线菌MY0504获得的包括菌体和胞外分泌的菌液以及仅含 胞外分泌物的菌液进行小鼠急毒试验,结果安全无毒性(具体试验情况参见实施方式);同 时发现该菌株对多种抗生素敏感,在实验和生产过程中,对环境和操作人员安全可靠。
【附图说明】
[0017] 图1为菌株MY0504在16SrRNA基因系统发育树中的位置;
[0018] 图2为菌株MY0504在电镜下的抱子生长状态;
[0019] 图3是菌株MY0504发酵液酶活示意图;
[0020] 图4是重铬酸钾对海泥菌落的抑制作用的示意图。
【具体实施方式】
[0021] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。
[0022] 本发明为一株海洋放线菌为链霉菌属放线菌MY0504 (Streptomyces sp.),该菌株 已于2015年3月25日保藏于中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号 CGMCC No. 10664,保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究 所。该菌株是从渤海海域海水中筛选出的。
[0023] 实施例1、菌株MY0504分离筛选
[0024] -、海水和海泥样本的保存:
[0025] 海水取样每瓶200ml,先冷藏,然后每瓶分装到灭菌离心管(50ml),取一瓶进行实 验,其余液氮保存,以备重复或进一步筛查。
[0026] 二、样本的预处理
[0027] 从不同瓶的海水样本中分别吸取1ml,每10个瓶取10ml,合并混匀,备用;海泥样 本或动物带泥沙分别称重约IOg混合,再与模拟海水比例1:5 (W/W)混合,摇床振荡30min, 备用。
[0028] 三、蛋白酶菌株初筛
[0029] 取海泥样本分别加入灭菌的K2Cr2O7 (重铬酸钾)溶液使浓度达到800 μ g/ml在 25°C振荡8小时,涂蛋白酶培养基(LB固体培养基加入0. 5%的灭菌奶粉)平板,25°C培养 2-5天,观察菌落透明圈,挑取透明圈大的菌落接入试管保存。重铬酸钾浓度对海泥菌落中 细菌数量有一定的抑制作用,可以去除一大部分的干扰菌落,具体可参见图4。
[0030] 四、产纤溶酶的菌株条件筛选
[0031] 将筛选得到有蛋白酶活性的菌落分别划线接种到纤溶酶筛选培养基(纤维蛋白 原80mg溶于75mlPBS溶液(0. 2mol/L磷酸盐)中,凝血酶4mg溶于5ml同样缓冲液中。将 100ml LB培养基化开,冷却到50°C,将纤维蛋白原溶液先加入,搅拌,然后加入凝血酶,搅拌 均匀。迅速倒平板,备用)中,观察菌落透明圈,挑取透明圈大的菌落进行初步分类,根据外 观和镜检的结果可以初步判断放线菌。
[0032] 五、常用抗生素对目标菌株的抑制作用实验
[0033] 将MY0504菌株的孢子用接种环挑取少部分在IOml无菌水中稀释,高速摇匀,备 用。将100mLPB培养基化开降温到45°C左右,加入2ml备用的孢子菌液,摇勾,铺平板。配 制如下抗生素的溶液(浓度见表1):青霉素、四环素、环丙沙星、庆大霉素、杆菌肽。取10 μ L 点到上述平板上,24°C恒温培养3天,测定抑菌圈的大小。抗生素周边某一直径的抑菌圈表 示对药物敏感,小于或根本没有说明该菌株对抗生素有抗性。采用Kirby-Bauer的检测方 法,参照各抗生素的敏感直径得出MY0504的敏感程度如表1。可以看出,该菌株对这几种抗 生素比较敏感,所以该菌株的实验开发等是相对安全的,不会引起不可控制的感染等,这也 利于该菌株的纤溶酶发酵应用。
[0034] 表1菌株MY0504对常用抗生素的敏感程度
[0036] 注:" + "为敏感,"++"为非常敏感
[0037] 实施例2、菌株MY0504的鉴定
[0038] 一、形态特征
[0039] 菌株MY0504在海水LB培养基中26°C培养48h,菌落奶白色,干燥,孢子椭圆形,圆 滑。
[0040] 二、生理生化性质
[0041] 该菌株的可培养条件为温度15
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