一株木质纤维素类物质高效降解菌m1及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株木质纤维素类物质高效降解菌Ml及其应用。
【背景技术】
[0002] 我国是一个农业大国，农业废弃物产生量极其巨大，由于受经济效益和技术普及 的限制，农业废弃物大都粗放低效利用且闲置状况严重，造成资源浪费和环境污染，废弃物 已经成为中国最大的污染源。而在农业废弃物存在着大量的木质纤维素，亟待人们去开发 利用。
[0003] 木质纤维素是自然界中仅次于纤维素的第二丰富的有机可再生资源，也是微生物 最难降解的成分之一。近年来，某些降解木质素的真菌已开始在实际中得以应用，但仍有待 进一步开发。木质素微生物降解的应用主要有：造纸工业；饲料工业；发酵与食品工业；生 物物肥料环境保护；木素酶的生物漂白技术，等等。
[0004] 目前农业有机固体废弃通常通过能源化利用、有机肥料、禽畜饲料、可食用菌培养 基料和工业原料进行利用。在利用农业废弃物的生产实践中，物理、化学和生物处理方法 经常结合使用，而其中生物处理方法尤其是利用微生物处理代表了今后的发展趋势。生物 方法就是指利用木质素降解酶去降解木质纤维材料中的木质素，从而使木质素-半纤维 素-纤维素结构解体，纤维素得以暴露出来供后续步骤处理与传统的机械、物理化学类法 相比，生物处理法的优点是能耗低，所需环境条件温和，避免了传统化学处理、机械处理技 术等耗能较多、存在环境污染等缺点，从成本和设备角度考虑，生物脱木质素法占有独特的 优势。但是，目前的生物处理法有一个很大的弱点限制了它的应用，这就是生物处理法中的 关键角色-木质素降解酶的活性普遍不高，从而导致处理效率较低，如果能利用基因工程 和传统的生物技术对菌种和酶进行改造，提高酶活力，降低酶成本，生物法脱木质素法则有 望应用于大规模工业生产。
[0005] 而目前应用最广泛的是微生物菌肥，微生物菌肥作为一种新的农业技术措施，在 发展高产、优质、高效农业中的作用逐渐被人们所认识。传统的微生物肥料己经在大面积推 广应用中，新型的微生物菌肥品种不断开发出来。微生物肥是由具有特殊效能的微生物经 过发酵而制成的、含有大量有益微生物、对作物有特定肥效的特定微生物制品。微生物肥料 利用微生物的生命活动，将作物不能吸收利用的物质转化为可被作物吸收利用的营养物， 改善作物的营养条件，有些兼有刺激作物生长或增强抗病性的作用，以提高作物产量，改善 农产品品质。它既能增加农产品的出日创汇，又具有工农业有机废物有效利用、防止环境污 染、改进土壤结构、提高土壤肥力和保护生态良性循环的巨大社会效益和生态效益。
[0006] 国内的研究大多数为真菌降解木质纤维素。但是，利用真菌降解木质纤维素普遍 存在酶活力较低的问题。由于克雷伯氏菌繁殖较快，发酵周期短，可应用于工业生产，且克 雷伯氏菌产生的纤维素酶一般作用条件为中性或偏碱性，这在制浆、造纸和洗涤剂工业等 污染行业的废水治理上有着潜在的应用前景，因此从克雷伯氏菌中筛选出有效菌株应用于 木质纤维素降解具有一定的实际意义及开发前景。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是为了提供一株木质素高效降解菌Ml及其应用。
[0008] 本发明的一株木质素高效降解菌为肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae) M1，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北 辰西路1号院3号，保藏日期为2014年12月12日，保藏号CGMCC No. 10162。
[0009] 本发明的一株木质素高效降解菌Ml用于降解木质素上。
[0010] 本发明的有益效果如下：
[0011] 本发明的肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae)Ml增值迅速，适应性强，应用 广泛耐盐性为NaCl浓度8%，耐热性为70°C;连续传代培养10次，菌株生长情况、产酶情况 以及酶活力稳定，无退化现象；对袋料木耳废料和玉米秸杆具有明显的降解效果，经肺炎克 雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae)Ml发酵处理后的袋料木耳废料的失重率在31%以上， 经肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae)Ml发酵处理后的玉米猜杆的失重率在30% 以上；具有显著的木质素降解能力，可以高效降解木质素，经复合微生物菌剂发酵处理的玉 米猜杆中木质素含量是经肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae)Ml发酵处理的玉米猜 杆中木质素含量的2倍，作为单一菌株肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae)Ml对木 质素的降解能力强于复合微生物菌剂；在降解样品时，不影响样品中的主要元素含量，不会 导致试样中的全氮、全磷、全钾、速效磷和速效钾含量变化，保存样品肥效。
[0012] 本发明从袋料木耳废料、林间朽木和林间土壤中分离筛选出能够以木质素为唯一 碳源生长的原始菌株，确定对木质素的降解能力以及种属关系，为将来复合微生物菌剂构 建奠定基础。将为我国农业资源的有效化利用提供有力帮助。
【附图说明】
[0013] 图1为本发明肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae)Ml培养12h后的扫描电 子显微镜图（X20, 000);
[0014] 图2为16S rDNA序列PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳检测图其中，1泳道为Maker DL2000,2泳道为菌株Ml ;
[0015] 图3为回收后的PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测图其中，1泳道为Maker DL2000, 2 泳道为菌株Ml ;
[0016] 图4为阳性克隆子筛选的琼脂糖凝胶电泳检测图其中，1泳道为Maker DL2000, 2 泳道为菌株Ml ;
[0017] 图5为本发明肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae)Ml的系统进化树；
[0018] 图6为本发明肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae)Ml对袋料木耳废料的失 重率图；
[0019] 图7为本发明肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae)Ml对玉米猜杆的失重率 图；
[0020] 图8为本发明肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae)Ml菌株降解后玉米猜杆 中各组分含量柱状图；其中，1为木质素含量柱状图；2为纤维素含量柱状图；3为半纤维素 含量柱状图；
[0021] 图9为本发明肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae)Ml菌株发酵处理后玉米 秸杆中全氮全磷和全钾含量柱状图；其中，1为全氮含量柱状图；2为全磷含量柱状图；3为 全钾含量柱状图；
[0022] 图10为本发明肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae)Ml菌株发酵处理后玉 米猜杆中速效磷含量柱状图；
[0023] 图11为本发明肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae)Ml菌株发酵处理后玉 米猜杆中速效钾含量柱状图。
【具体实施方式】
【具体实施方式】 [0024] 一：本实施方式的一株木质纤维素类物质高效降解菌M1，它为肺炎 克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae)Ml，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2014年12月12日， 保藏号 CGMCC No. 10162。
[0025] 本实施方式的肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae)Ml为革兰氏阴性菌，该 菌株菌体形态为杆状，菌体大小为0. 62~0. 71 X 1. 5~1. 6 μ m，不形成芽孢，无鞭毛，有荚 膜，；在LB培养基上形成圆形、不透明、黄色、突起光滑、边缘整齐的菌落（如图1所示）。
[0026] 该菌株的生理生化反应结果共20项、30个指标；结合形态与生理生化反应结果， 比对《伯杰氏克雷伯氏菌鉴定手册》确定该菌株的种属，结果如表1所示。
[0027] 根据《常见克雷伯氏菌系统鉴定手册》和《伯杰克雷伯氏菌手册》对分离出的克雷 伯氏菌（Klebsiella sp.)Ml进行进行革兰氏染色、氧化酶、接触酶、荧光色素、甲基红、七叶 苷溶解、明胶液化、石蕊牛乳胨化及产酸、脂酶、淀粉水解、V. P.测定、柠檬酸盐利用、纤维素 降解、3-酮基乳糖利用、苯丙氨酸脱氨酶、色氨酸脱氨酶、耐热热性、耐盐性生理生化实验的 检测和鉴定。结果表明克雷伯氏菌（Klebsiella sp.)Ml为革兰氏阴性菌，耐盐性为NaCl 浓度8%，耐热性为70°C，可产生接触酶、脲酶和色氨酸脱氨酶，但不能产生氧化酶、脂酶、 苯丙氨酸脱氨酶和荧光色素，甲基红、柠檬酸盐利用、淀粉水解、明胶液化、糖醇发酵（甘 露糖）、七叶苷溶解和石蕊牛乳产酸表现为阳性，V. P.试验、石蕊牛乳胨化、纤维素降解和 3_酮基乳糖利用表现为阴性。
[0028] 表1菌株Ml的形态学特征与生理生化鉴定结果
[0029]
[0031] 本实施方式的木质素高效降解菌为肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae)Ml 的筛选方法如下：
[0032] 1、筛选方法
[0033] 取IOg样品在无菌条件下充分研磨，加入装有90mL无菌水（带玻璃珠）的三角瓶 中，振荡20min。取5mL样品悬液接入装有IOOmL液体LB培养基的三角瓶中，37°C，180r/ min振荡培养8h ;将菌液分别制成稀释度为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的样液，各取 200 μ L涂于木质素筛选培养基平板，37°C恒温培养48h，根据菌落生长情况调整稀释梯度。 保持培养