一种ecce-cik细胞培养方法及ecce-cik细胞制剂的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种细胞的培养方法。具体涉及一种ECCE-CIK细胞培养方法及ECCE-CIK细胞制剂。
【背景技术】
[0002]细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-1nduced killer cells，CIK)是指经IFN-γ、⑶3单克隆抗体、IL-2等细胞因子体外有序激活人外周血单核细胞(PeripheralBlood Mononuclear Cells，PBMC)而获得的异质免疫细胞群，于1991年被美国斯坦福大学Schmidt-Wolf首次发现并命名。因其具有增殖速度快、杀瘤活性高、杀瘤谱广、副作用小、对正常骨髓造血影响轻微等优点，被认为是新一代肿瘤过继免疫治疗的首选细胞群。然而，由于肿瘤病人的免疫功能处于抑制或免疫耗竭状态，传统CIK细胞培养技术在临床应用时个体差异较大，迫切需要建立新的培养技术，提高CIK细胞的扩增效率和杀伤活性。
[0003]人工抗原递呈细胞(artificialantigen presenting cells，aAPC)通过模拟 T细胞活化的双重信号机制，在一定的载体表面表达抗原肽-MHC分子复合物及共刺激分子、粘附分子的配体或抗体，能有效活化和扩增抗原特异性Τ细胞，且效率高、可行性好。ECCE(Engineered Cells for Costimulatory Enhancement)是通过表达人肿瘤坏死因子超家族分子 9 (human tumor necrosis factor superfamily member 9，CD137L)的逆车专录病毒感染K562细胞，并使其稳定表达而形成的新型aAPC。K562细胞不表达MHC分子，能够避免异体移植物的免疫排斥反应，因此ECCE细胞不同于其他的aAPC系统，能够应用于临床级别免疫细胞的制备。此外，ECCE细胞在进入CIK细胞培养体系前，经过lOOGy伽马射线30分钟的灭活照射，因此，将ECCE细胞应用于制备临床级别的CIK细胞是安全的。
[0004]目前大多数的研究都尝试通过增加细胞因子(如IL-21等)刺激或通过与自体DC细胞共培养提高CIK细胞的增殖效率和杀伤活性，然而，对于经过放化疗、免疫功能低下的患者，其效果并不是很明显。利用aAPC激活免疫细胞，在制备临床级别的NK细胞、抗原特异性T细胞、γ δΤ细胞有广泛的研究。本发明首次将ECCE细胞引入CIK细胞培养体系，明显增加了 CIK细胞的增殖活性并提高了 CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性，有望扩大自体CIK细胞治疗肿瘤的临床应用范围并提高其疗效。
【发明内容】
[0005]本发明是为了解决传统CIK细胞培养个体差异大，无法获得足够数量高杀伤活性的CIK细胞的问题，提供一种ECCE-CIK细胞培养方法及ECCE-CIK细胞制剂，将ECCE细胞引入CIK细胞培养体系，大大提高传统CIK细胞的增殖活性和细胞毒活性，为临床自体CIK细胞治疗肿瘤提供了一种新的高效的CIK细胞培养方法，我们将这种高效能的CIK细胞简称为ECCE-CIK细胞。本发明有望提高自体CIK细胞治疗肿瘤的疗效。
[0006]本发明采用的技术手段为:
一种ECCE-CIK细胞培养方法，包括如下步骤: 1)分离人外周血单核细胞(PBMC);
2)制备PBMC细胞悬液；
3)激活PBMC ；
4)培养激活后的细胞；
5)收集细胞；
步骤1)中所述的分离人PBMC是采用Ficoll密度梯度离心法。
[0007]步骤2)中所述的制备PBMC细胞悬液是用无血清淋巴细胞培养液将PMBC浓度调整到1.0*106个/mL浓度接种于培养瓶中。
[0008]步骤2)中所述的无血清淋巴细胞培养液为:德国美天旎公司的TexMACS GMPMedium。
[0009]步骤3 )中所述的激活PBMC的方法如下:
①在步骤2)制备的细胞悬液中加入IFN-γ (终浓度1000-2000U/mL)、经伽马射线灭活的ECCE细胞(终浓度为105-106个ECCE细胞/mL)，置于37°C、5%C0 2、湿度100%培养箱内培养24小时；
②加入ant1-CD3单克隆抗体(终浓度50_100ng/mL)、IL-2(终浓度300-1000U/mL)，置于37°C、5%C02、湿度100%培养箱内继续培养；
步骤4)中所述的培养激活后的细胞是指根据细胞增殖的速度，每2-3天添加含有IL-2(终浓度300-1000U/mL)的无血清淋巴细胞培养液。
[0010]步骤5)中所述的收集细胞是指培养至14-21天后，1600转/分钟，4°C，离心5分钟，弃上清，用含有10% (v/v) 二甲基亚砜(DMS0)、90% (v/v)胎牛血清(FBS)的冻存液冻存细胞，置于液氮中保存。
[0011]步骤3)中所述ECCE细胞是通过表达人肿瘤坏死因子超家族分子9 (⑶137L)的逆转录病毒感染K562细胞系，稳定表达CD137L分子，用于体外诱导CIK的人工抗原递呈细胞；
步骤3)中所述经伽马射线灭活的ECCE细胞按如下步骤制备:
①体外扩增ECCE:
RPM1-1640培养基加入10% (v/v)FBS、l% (v/v)青霉素、1% (v/v)链霉素配制完全培养基；将ECCE细胞按2.0*106的浓度接种于完全培养基，置于37°C、5% (v/v) C02、湿度培养箱内培养；根据细胞增殖的速度，每2-3天加入新鲜的完全培养基。
[0012]②伽马射线照射ECCE细胞:
将培养的ECCE细胞收集起来，用lOOGy的伽马射线照射30min。
[0013]一种ECCE-CIK细胞制剂，包括由上述ECCE-CIK细胞培养方法培养得到的ECCE-CIK 细胞。
[0014]本发明的有益效果:
与传统的CIK细胞培养技术相比，本发明的关键因素是在培养体系中引入了 ECCE细胞。一方面，ECCE细胞表面的粘附分子ICAM-1 (⑶54)、LFA-1 (⑶58)及B7-H3等，能够增加ECCE与T细胞的相互作用。另一方面，ECCE细胞表面的⑶137L与T细胞表面的⑶137结合激活T细胞的协同刺激信号，促进T细胞的增殖及细胞因子的分泌。此外，CD137信号的激活还可以预防激活诱导的T细胞死亡、延长CD8+T细胞的生存时间并促进记忆性T细胞的分化。
[0015]本发明在传统CIK细胞培养方法的基础上，将ECCE细胞引入CIK细胞培养体系，使ECCE-CIK细胞比传统CIK细胞增殖能力强、杀伤活性高，有望使更多的肿瘤患者能够从CIK细胞治疗获益并提高整体疗效。
[0016]
【附图说明】
[0017]图1:动态监测C0N-CIK和ECCE-CIK组CIK细胞的增殖能力，#2号患者不同时间CIK细胞的增殖数目，如图所示ECCE能够明显提高CIK细胞的扩增速度。
[0018]图2:培养第21天，C0N-CIK和ECCE-CIK组CIK细胞平均扩增倍数(n=20)，经配对t检验，p < 0.01，差异具有明显的统计学意义，说明ECCE能够明显提高CIK的扩增倍数；
图3:不同效靶比时，C0N-CIK和ECCE-CIK组CIK细胞对肝癌细胞系SMMC7721的杀伤效率的流式检测结果，如图所示，当效靶比为40:1时，P6组C0N-CIK细胞的杀伤效率是28.4%，E5P6组ECCE-CIK细胞的杀伤效率是84.6%，E6P6组ECCE-CIK细胞的杀伤效率是90.8%，说明ECCE能够明显增强CIK细胞对SMMC7721的杀伤作用；
图4:不同效靶比时，20组C0N-CIK和ECCE-CIK组CIK细胞对肝癌细胞系SMMC7721的平均杀伤效率，经配对t检验，p值均小于0.01，说明ECCE能够明显增强CIK细胞对SMMC7721的杀伤效率；
图 5:C0N-CIK 和 ECCE-CIK 组 CIK 细胞表型的变化:E6P6 组 CD3+CD8+ 和 CD3+CD56CIK 细胞明显增多(84.6 土 2.6% vs 81.7 土 3.7%，P < 0.05 ；54.3 土 4.2% vs 44 土3.5%，Ρ < 0.01)，而 CD3+CD56+ 明显降低(33.2 ± 4.1% vs 21.2 ± 3.5%，P < 0.01)。
[0019]图6:比较C0N-CIK和ECCE-CIK组CIK细胞上清中IFN- γ和TNF- α的分泌情况，结果显示ECCE能够明显增强CIK细胞IFN- γ和TNF- α的分泌。
[0020]
【具体实施方式】
[0021]实施例1经放射灭活的ECCE细胞的制备
1、ECCE细胞来源:
ECCE细胞由美国波特兰肿瘤研究中心胡红铭教授惠赠。ECCE细胞是通过表达人肿瘤坏死因子超家族分子9 (⑶137L)的逆转录病毒感染Κ562细胞系，稳定表达⑶137L分子的新型aAPC。
[0022]2、ECCE细胞的培养方法:
RPM1-1640培养基加入10% (v/v) FBS、1% (v/v)青霉素、1% (v/v)链霉素配制完全培养基；将ECCE细胞按2.0*106的浓度接种于完全培养基，置于37°C、5%C02、湿度培养箱内培