一种nkt细胞的培养方法和用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及细胞培养领域，尤其涉及一种NKT细胞的培养方法和用途。
【背景技术】
[0002] 自体免疫细胞疗法是肿瘤生物治疗的重要方法之一。自体免疫细胞疗法是将从自 体外周血中分离出单个核细胞，在多种免疫活性因子的作用下，通过体外培养，有效活化和 扩增为免疫活性细胞，包括NK细胞、CIK细胞和NKT (naturalkiIlerT)细胞等，再输入患者 体内，使免疫细胞直接杀伤肿瘤细胞或病毒感染细胞，或调节和增强机体的免疫功能的治 疗方法
[0003] NKT细胞是人外周血单个核细胞在体外经IL-2等多种细胞因子刺激后，获得的以 表达CD3+CD6 +标志为主的免疫效应细胞，具有T淋巴细胞的杀瘤活性，为新一代杀伤效应细 胞。NKT细胞的主要特征为T细胞受体（TCR)基因表达的恒定性、CDld的限制性以及细胞 因子产生的迅速、高水平性。NKT细胞既能增强免疫反应又能抑制免疫反应，从而在抗肿瘤、 抗感染、抑制自身免疫性疾病及移植耐受中发挥重要作用。NKT细胞虽也以⑶3 +⑶6+标志 的细胞为效应细胞，但是和CIK细胞的不同，NKT来源于外周血中CD4 CD8标志的细胞。
[0004] 目前NKT细胞的制备方法一般是直接分离外周血中的单个核细胞（PBMC)，然后将 PBMC在含有一定浓度的IL-2、IL-15的培养基中培养2周得到NKT细胞。但现有技术中培 养得到的NKT细胞杀伤活性较低。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，有必要针对现有技术中NKT细胞杀伤活性低的问题，提供一种NKT细胞 的培养方法和用途。
[0006] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0007] -种NKT细胞的培养方法，包括将巨噬细胞与NKT细胞共培养的步骤。
[0008] 优选地，所述NKT细胞的培养方法，包括以下步骤：
[0009] Sl、细胞的分选：
[0010] 自PBMC中分选出单核细胞；
[0011] S2、巨噬细胞的诱导：
[0012] 将步骤Sl分选得到的单核细胞诱导为巨噬细胞；
[0013] S3、NKT细胞的诱导：
[0014] 将步骤Sl分选剩余的细胞诱导为NKT细胞；
[0015] S4、巨噬细胞和NKT细胞共培养：
[0016] 将S2获得的巨噬细胞和S3获得的NKT细胞共培养7-8天。
[0017] 优选地，所述步骤S2中使用肿瘤细胞裂解液上清刺激巨噬细胞。
[0018] 优选地，所述步骤S2中巨噬细胞的诱导具体方法为：用巨噬细胞诱导培养基培养 单核细胞，培养至第4天加入肿瘤细胞裂解液上清，培养至第6天收集巨噬细胞；所述巨噬 细胞诱导培养基的组成为：500-1000U/mL GM-CSF(粒细胞和巨噬细胞集落刺激因子）、体 积分数3-10%自体血浆、余量为X-VIVO 15无血清培养基。
[0019] 优选地，所述肿瘤细胞裂解液上清中蛋白终浓度为1-10 μ g/mL，优选5 μ g/mL。肿 瘤细胞裂解液上清可以促进巨噬细胞的增殖和成熟，增强巨噬细胞对肿瘤细胞的识别作用 和杀伤活性。所述肿瘤细胞裂解液通过反复冻融方法制备。
[0020] 优选地，所述步骤S3中NKT细胞的诱导具体方法为：用NKT细胞用培养基培养步 骤Sl分选后剩余的细胞，培养至第6天收集NKT细胞；所述NKT细胞用培养基的组成为： 100-500U/mL IL-2 (白细胞介素-2)、10-100 μ g/mL IL-15 (白细胞介素-15)、10-100 μ g/ mL IL-21(白细胞介素-21)、余量为X-VIVO 15无血清培养基。
[0021 ] 优选地，所述步骤S4中巨噬细胞和NKT细胞共培养具体方法为：将S2获得的巨噬 细胞和S3获得的NKT细胞用NKT细胞用培养基共同培养7-8天。
[0022] 优选地，步骤S2-S4中的培养条件为37°C、5% C02。
[0023] 优选地，所述步骤S2-S4在培养过程中按照I X 106cells/mL的细胞密度补加培养 液和细胞因子。
[0024] 优选地，巨噬细胞与NKT细胞按数量比1:10-25共培养。
[0025] 更优选地，巨噬细胞与NKT细胞按数量比1:15-20共培养。
[0026] 更进一步优选地，巨噬细胞与NKT细胞按数量比1:20共培养。
[0027] 本发明还提供巨噬细胞的用途，巨噬细胞用于增强NKT细胞杀伤活性的用途。
[0028] 与现有技术相比，本发明提供的巨噬细胞培养方法有以下优点：
[0029] 本发明将单核细胞从单个核细胞中分选出来，然后采用一定浓度的GM-CSF对单 核细胞进行诱导，使之成为巨噬细胞。PBMC分选出单核细胞后的剩余细胞为悬浮细胞，将悬 浮细胞培养成NKT细胞，之后将巨噬细胞和NKT细胞二者共培养。巨噬细胞可以直接吞噬 细胞，同时也具有一定的抗原提呈功能，故将巨噬细胞与NKT细胞共培养，直接提高了 NKT 细胞的杀伤活性。
[0030] 本发明采用特异性的肿瘤细胞裂解液上清对巨噬细胞进行刺激，得到的巨噬细胞 抗原提呈能力更强。如NKT细胞对K562细胞进行杀伤时，在培养巨噬细胞的时候，采用K562 细胞裂解液上清对巨噬细胞进行刺激。NKT细胞对HL60细胞进行杀伤时，在培养巨噬细胞 的时候，采用HL60细胞裂解液上清对巨噬细胞进行刺激。
【附图说明】
[0031 ] 图1为本发明NKT细胞的培养方法的流程图。
[0032] 图2为本发明实施例1中细胞形态图。其中，图2A和图2B分别为NKT细胞诱导 第1天、第6天的形态，图2C和图2D分别为NKT细胞与巨噬细胞共培养第1天、第7天的 形态。
[0033] 图3为本发明实施例1中获得的巨噬细胞的流式检测结果图。
[0034] 图4为本发明效果实施例1中流式检测结果图。其中图4A和图4B为采用实施例 1方法获得的NKT细胞，图4C和图4D为采用对比例1方法获得的NKT细胞。
[0035] 图5为效果实施例3中增殖曲线图。
【具体实施方式】
[0036] 为了更好的说明本发明，下面结合附图和具体实施例做进一步说明。本发明中 K562细胞（人白血病细胞）、HL60细胞（人原髓细胞白血病细胞）和H印G2细胞（人肝癌 细胞）由暨南大学生物医药研究基地惠赠，所用试剂或仪器均可由市场购得，使用的检测 方法等都是本领域所熟知的，在此不再赘述。
[0037] 实施例1、NKT细胞的培养方法
[0038] -种NKT细胞的培养方法，包括以下步骤：
[0039] Sl、细胞的分选：用⑶14分选试剂盒（购自STEM CELL公司）自PBMC悬液中分选 出单核细胞（CD14+细胞），剩余细胞为悬浮细胞（CD14细胞）。
[0040] S2、巨噬细胞的诱导：用巨噬细胞诱导培养基重悬单核细胞，按照 I X 106-2X IO6ceIlsAiL的密度接种至细胞培养瓶中，用巨噬细胞诱导培养基于37°C、5 % CO2条件下培养，定期进行观察，每隔2-3天按照I X 10 6CellsAiL的细胞密度补加培养液和 细胞因子。培养第4天加入蛋白终浓度5 μ g/mL的K562细胞裂解液上清进行刺激，第5天 收集部分细胞进行流式鉴定，第6天收集巨噬细胞。所述巨噬细胞诱导培养基的组成为： 500U/mL GM-CSF、体积分数5%自体血浆，余量为X-VIVO 15无血清培养基。
[0041] S3、NKT细胞的诱导：用NKT细胞用培养基重悬悬浮细胞，按照 I X 106-2X Kfcells/mL的密度接种至细胞培养瓶中，用NKT细胞用培养基在37°C、5% CO2 条件下培养。定期在倒置显微镜下观察细胞的状态，每隔1-2天按照I X Kfcells/mL的细 胞密度补加培养液和细胞因子。第6天收集NKT细胞。所述NKT细胞用培养基的组成为： lOOU/mL IL-2、50yg/mL IL-15、100yg/mL IL-21，余量为 X-VIVO 15 无血清培养基。
[0042] S4、巨噬细胞和NKT细胞共培养：将第6天收集的巨噬细胞和NKT细胞按照1:10 的数量比，以I X 1〇6_2 X 106cells/mL的密度接种，用NKT细胞用培养基共培养，培养至第14 天（共培养8天）收集细胞共培养物。
[0043] NKT细胞形态及共培养时两种细胞的形态如图2所示。图2A和图2B分别为NKT 细胞诱导第1天、第6天的形态；NKT细胞诱导第1天，细胞较少，体积较小，培养至第6天 时，细胞数增多，体积变大，核质比更加明显。图2C和图2D分别为NKT细胞与巨噬细胞共 培养第1天、第7天的形态；与巨噬细胞共培养后，NKT细胞增殖更快，细胞体积更大。巨噬 细胞的流式检测结果如图3所示，由图3A和图3B可知，巨噬细胞的⑶14⑶Ilb +的比例为 98. 7%，说明本实施例中获得的巨噬细胞的纯度非常高。
[0044] 使用的自体血浆、PBMC可以通过常规方法制备。本发明中制备PBMC的具体方法 如下：
[0045] 将抗凝管中的外周血转移到离心管中，400-500g离心5-10min，离心结束后将上 层血浆收集于另一支离心管中，在56°C的水浴锅中进行热灭活，然后用0. 22 μ M的一次性 滤器过滤，标记后置于4°C冰箱，备用。
[0046] 将下层血细胞转移到50mL离心管中，加入两倍体积的生理盐水进行稀释。另取一 支新的s印mate离心管（购自STEM CELL公司），加入Ficoll淋巴细胞分离液（购自STEM CELL公司）12mL，将稀释后的血细胞转移到sepmate离心管，600_800g离心15_20min。离 心后，将上层液体倒出，加入生理盐水进行洗