一种杂交瘤细胞株及其分泌的抗体和制备方法、应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗甲基安非他明杂交瘤细胞株和抗甲基 安非他明单克隆抗体。
[0002] 还涉及抗甲基安非他明单克隆抗体作为检测甲基安非他明的应用，以及制备该抗 甲基安非他明杂交瘤细胞株并分泌抗甲基安非他明单克隆抗体的方法。
【背景技术】
[0003] 甲基安非他明（Methamphetamine，MET),化学名为N-甲基-1-苯基-丙烷-2-胺， 其结构式为：
[0005] 甲基安非他明（Methamphetamine)，又称甲基苯丙胺，俗称"冰毒"，它属于精神类 药品，是一种拟交感胺药，医疗上用于治疗注意力不足过动症（ADHD)、嗜睡症、极端的肥胖 症、后脑炎、帕金森综合症等，过度服用极易导致精神病状态，表现出活动过度，情感冲动， 野蛮，妄想，偏执狂，幻觉甚至有杀人倾向。此种状态过后，出现一种极度衰竭和抑郁状态， 也有因严重抑郁而自杀者。长期滥用可造成慢性中毒、体重下降、消瘦、溃疡、脓肿、指甲脆 化和夜间磨牙。甲基安非他明耐受性随长期使用而增加，对于未产生耐受的人，使用甲基安 非他明30毫克便会引起中毒。而有报道，长期滥用者，为了达到初期使用时的欣快效应，竟 将剂量增至2000毫克，这极易引起急性中毒，可造成惊阙、昏迷甚至死亡。具有极大的社会 危害性。
[0006] 在甲基安非他明的检测中，国内外主要采取免疫层析法、酶联免疫吸附法 (ELISA)、气相色谱-质谱联用、高效液相色谱法、放射性免疫对尿液、血液、组织以及毛发 等样本进行检测。尿液样本涉及到伦理与隐私，对于采样存在一定困难和样本的保真性存 在一定怀疑；血液样本涉及伦理和创伤，对于供样人有一定的感染风险；组织和毛发等样 本需要进行前处理，检测需要大型仪器设备，技术要求高，不适合现场快速检测。
[0007] 其中唾液是唯一已成功的用来替代血液进行动力学和一些药物毒理学研究的体 液，其中包括滥用药物的研究。药物的唾液浓度与血液浓度的比值（S/P比值）相对恒定，变 异率小，对估计药物在体内的代谢水平具有重要的意义。甲基安非他明唾液检测机制：甲基 安非他明从血液进入到唾液，原药比代谢物更具有亲脂性，更易通过脂肪膜屏障进入唾液， 因此唾液的毒品检测物为毒品原体；而甲基安非他明的尿液检测机制是通过血液通过肝肾 代谢，其中40%仍为原药甲基安非他明，其它通常以安非他明衍生物从尿液中排泄出来。因 此唾液检测的是甲基安非他明原药，而尿液检测的是甲基安非他明以及安非他明衍生物， 唾液检测更优于尿液检测。
[0008] 目前国际通用的甲基安非他明诊断阈值为l〇〇〇ng/ml，主要用于尿液检测。而唾液 中甲基安非他明的含量较低，应用于唾液检测的抗甲基安非他明单克隆抗体要求更高的灵 敏度和亲和力，本发明甲基安非他明唾液检测试剂盒利用胶体金免疫层析技术定性检测唾 液中是否含有甲基安非他明，其检测阈值可达到50ng/ml，完全能够满足唾液检测的需要。
【发明内容】
[0009] 本发明的一个目的是提供一种产生抗甲基安非他明单克隆抗体的杂交瘤细胞株 METL 0,保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC N0:C2013160,已于2013年11 月12号交中国典型培养物保藏中心（CCTCC)保藏，保藏地址：湖北省武汉市武昌区武汉大 学内，保藏编号：CCTCC N0:C2013160。
[0010] 本发明的第二个目的是提供一种抗甲基安非他明单克隆抗体，它是由保藏编号为 CCTCC NO: C2013160的抗甲基安非他明杂交瘤细胞株MET 1. 0分泌产生，能特异性结合甲基 安非他明，分泌出的抗甲基安非他明单克隆抗体属于IgGl亚型，轻链是kappa链。
[0011] 本发明的第三个目的是提供一种制备所述的由保藏编号为CCTCC N0:C2013160的 抗甲基安非他明杂交瘤细胞株METLO分泌产生的抗甲基安非他明单克隆抗体的方法，在 制备甲基安非他明人工抗原的过程中利用三氟乙酸酐保护氨基基团，使戊二酸酐能准确结 合在其间位上，增强了抗原的免疫原性，有利于制备高亲和力的抗甲基安非他明单克隆抗 体。
[0012] 其中，甲基安非他明人工抗原是这样制备的：
[0013] 50mL单口瓶中，500mg甲基苯丙胺，用氨水碱化至PH = 9,用乙酸乙酯提取得到 390mg淡黄色油状物B，冰浴下加入400ul三氟乙酸酐，搅拌2h后升温至80°C回流过夜，次 日减压蒸干后用乙酸乙酯提取，浓缩得到600mg黄色油状物C，再加入等质量的戊二酸酐， 萃取剂200mg，升温至120°C反应48h，再用乙酸乙酯提取得到750mgD，用38mLDMF下溶解， 加入380mgNHS和675mgDCC，搅拌过夜，离心取上清活化液，得到200ml的BSA中（浓度为 20mg/ml)搅拌过夜，用PH = 12的似20)3透析三天后再用PH = 7. 4的PBS透析三天，离心 后的上清液即为人工抗原。用高效液相色谱仪纯化甲基安非他明人工抗原，抗原纯度可达 95%以上。
[0014] 进一步的，在制备由保藏编号为CCTCC N0:C2013160的抗甲基安非他明杂交瘤细 胞株METLO分泌产生的抗甲基安非他明单克隆抗体的方法中，免疫过程中采用新型免疫 佐剂联合抗原免疫小鼠，具有无需乳化、抗原量少、免疫时间短（仅需5周）、不破坏抗原构 象、无毒、促使B淋巴细胞增多，有利于融合等优点。
[0015] 其中，小鼠免疫过程是这样的：
[0016] 选择8-12周龄的BALB/c雄鼠用甲基安非他明人工抗原注射靠近淋巴结皮下部位 进行免疫，本实验具体步骤是取8周龄的BALB/c雄鼠，甲基安非他明人工抗原（以MET-BSA 为免疫抗原）注射靠近淋巴结皮下部位，注射四点，共四次免疫，每次免疫间隔两周：第一 次用PBS缓冲液将甲基安非他明人工抗原20ug/只稀释至150ul，得到稀释抗原与等体积 的新型免疫佐剂（主要成分为细菌DNA);第二次用PBS缓冲液将甲基安非他明IOug/只人 工抗原免疫量稀释至150ul，得到稀释抗原与等体积的新型免疫佐剂；第三次加强免疫，用 PBS缓冲液将甲基安非他明20ug/只人工抗原免疫稀释至150ul，联合等体积的新型免疫佐 剂免疫小鼠，饲养一周后处死小鼠，处死前3天用甲基安非他明人工抗原20ug/只做一次加 强免疫。
[0017] 本发明的第四个目的是提供用于检测唾液中甲基安非他明的试剂盒，它包括支持 物、样品垫、胶体金纸片、硝酸纤维素膜和吸水垫，支持物上从加样端开始依次粘贴有样品 垫、胶体金纸片、硝酸纤维素膜和吸水垫，硝酸纤维素膜上有检测区和对照区，检测区包被 有由保藏编号为CCTCC N0:C2013160的抗甲基安非他明杂交瘤细胞株METL 0分泌产生的 抗甲基安非他明单克隆抗体，对照区包被羊抗鼠多克隆抗体。该试剂盒最低检出限为50ng/ ml，通过与40多种常用滥用药物和分子结构类似物，以及常见的戒毒药物、安眠药物、麻醉 药物、止咳药物、感冒药物的交叉反应实验表明，本发明对这些物质无交叉反应，特异性强。
[0018] 本发明的第五个目的是提供一种由保藏编号为CCTCC N0:C2013160的抗甲基安非 他明杂交瘤细胞株METL 0分泌产生的抗甲基安非他明单克隆抗体在检测甲基安非他明中 的应用。
[0019] 本发明所具有的有益效果：
[0020] 1、甲基安非他明是不具有免疫原性的小分子物质，本发明在甲基安非他明人工 抗原制备过程中，利用三氟乙酸酐保护甲基安非他明的氨基，选择支链较长的戊二酸酐作 为交联剂，使戊二酸酐能准确的结合在甲基安非他明的间位位点上，既提高甲基安非他明 的免疫原性，有利于制备得到高亲和力的抗甲基安非他明单克隆抗体，又提高了甲基安非 他明人工抗原的有效产量。
[0021] 2、本发明在制备抗甲基安非他明单克隆抗体过程中，采用新型免疫佐剂联合抗原 免疫小鼠，制备得到高亲和力的单克隆抗体，与常规免疫方法相比，具有无需乳化、抗原量 少、免疫时间短（仅需5周）、不破坏抗原构象、无毒、促使B淋巴细胞增多，有