一种猪圆环病毒2型大规模培养的方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于兽用生物制品领域，更具体涉及一种猪圆环病毒2型大规模培养的方 法及其应用。
【背景技术】
[0002] 猪圆环病毒2型（简称PCV2)感染引起的断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMffS)、猪 呼吸疾病综合征（PRDC)、猪皮肤和肾病综合征（PDNS)等多种疾病（总称为猪圆环病毒病， PCVDs)，其临床特征为体重逐渐减轻，以及体征例如呼吸急促、呼吸困难和黄疸。从病理学 观点来看，其表现为淋巴细胞或肉芽肿浸润，淋巴结病以及较罕见的肝炎和淋巴细胞或肉 芽肿性肾炎。PCV2感染性疾病引起得死亡率增高、饲料报酬降低，加上我国规模化主场饲养 管理水平相对较为落后，因此PCVD也给我国的养猪业造成了巨大的经济损失。
[0003] 随着PCV2疫苗的出现，使用PCV2抗原制成的疫苗在对PMffS的预防中初见成效。 目前生产猪圆环病毒2型灭活疫苗主要有两种技术：（1)生物反应器技术；(2)转瓶技术。 转瓶技术生产细胞和病毒时劳动强度大、占地大、批间差异大、生产成本高、单批产量低；生 物反应器技术虽然在一定程度上解决了转瓶技术的部分缺陷，但仍不能摆脱转瓶生产过程 中所需要添加血清的缺点，不利于下游工艺分离纯化，制备的疫苗易引起动物副反应；现有 技术中无论是采用生物反应器技术还是采用转瓶技术，接毒时均需要添加 D-氨基葡萄糖 处理，接毒过程复杂、繁琐，减少对细胞的毒副作用。因此，就需要获得一种猪圆环病毒2型 大规模培养的方法，以克服上述缺陷，用于制备安全、有效的猪圆环病毒2型疫苗。
【发明内容】
[0004] 为解决现有技术的不足，本发明提供了一种猪圆环病毒2型大规模培养的方法及 其应用。
[0005] 本发明的主要目的在于提供一种猪圆环病毒2型大规模培养的方法，所述方法包 括：（1)用低血清培养基培养PKK细胞；（2)将步骤（1)形成良好单层的PKK细胞用胰蛋白 酶消化，制备细胞悬液，接种到含有微载体的生物反应器中，并同时接种猪圆环病毒2型进 行吸附；（3)病毒吸附之后进行病毒培养；(4)同步接毒72h后进行收毒,每天收获一个体 积，连续收获。
[0006] 优选地，步骤⑴使用的低血清培养基为OptiMEM低血清培养基，不额外添加血 清，于37°C 5% CO2的条件下培养48-72h。
[0007] 优选地，步骤⑵细胞的接种密度为3X IO5个/ml~2X IO6个/ml，微载体的添 加量为5g~20g/L。
[0008] 优选地，步骤（2)微载体为Cytodex-I。
[0009] 优选地，步骤（2)微载体经过硅化处理，处理程序为用无 Ca2+，Mg2+离子的PBS 缓冲液清洗Cytodex-I微载体并浸泡3h，所用浸泡的玻璃容器应提前用硅化剂处理，经 121°C 25min高压灭菌处理，冷却后4°C密封保存备用，使用前用37°C的细胞培养液清洗3 遍。
[0010] 优选地，步骤（2)同步接毒剂量按Μ. 0.1 . =0.2,并同时补加生物反应器工作体积 的1/3量的OptiMEM低血清培养基吸附2h。
[0011] 优选地，步骤（2)接种的猪圆环病毒2型为猪圆环病毒SH株。
[0012] 优选地,步骤（2)病毒吸附程序为搅拌20-30min，停止15-20min，周期间歇性搅 拌。
[0013] 优选地，步骤（3)病毒吸附之后继续补加无血清无蛋白培养基至生物反应器工作 体积，进行病毒培养。
[0014] 优选地，步骤（3)病毒培养程序为DO为50 %~60 %，搅拌转速为50~70rpm，采 用压缩Air、O2、N2和CO2四气模式条件培养。
[0015] 优选地，步骤（4)同步接毒72h第一次收毒后补加等体积的OptiMEM低血清培养 基，每天收获一次，连续收获至少5天。
[0016] 优选地，步骤（4)收获的猪圆环病毒2型病毒液滴度为彡l(f5TCID 5Q/ml。
[0017] OptiMEM低血清培养基为一种化学成分限定培养基，本发明使用时，不额外添加任 何血清。
[0018] 本发明还提供了一种猪圆环病毒2型灭活疫苗大规模培养方法：将本发明制备的 猪圆环病毒2型病毒液灭活，加入佐剂制备猪圆环病毒2型灭活疫苗。
[0019] 利用本发明方法制备的猪圆环病毒2型疫苗具有以下优势：
[0020] 1利用生物反应器在OptiMEM低血清培养基中培养细胞繁殖猪圆环病毒2型，降低 了培养细胞时对血清的依赖性，避免了血清的使用带来的外源性蛋白产生的副反应，而且 血清的价格昂贵，存在批次间的差异，并且生产成本有较大的降低；
[0021] 2利用生物反应器添加微载体培养细胞时用OptiMEM低血清培养基，在搅拌时由 于不含血清，可大量减少气泡的生成，降低细胞剪切力，细胞可高密度快速增值；
[0022] 3利用本发明方法在生物反应器中可实现连续收获5天，病毒含量均达到 107· 5TCIDmAiI，提高了病毒收获率，大大提升了生产效率，为规模化生产奠定了基础；
[0023] 4本发明方法利用OptiMEM低血清培养基培养PKK细胞用于生产猪圆环病毒2型， 意外发现，接毒时无需添加 D-氨基葡萄糖，依然能得到较高滴度的猪圆环病毒2型病毒液。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更 为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人 员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进 行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0025] 本发明实施例中所用PBS缓冲液如无特别说明，均采用pH7. 4的PBS，配制方法： NaCl 8. 0g，KCl 0· 2g，KH2PO4O. 24g，Na2HPO4 · 12Η203· 628g，溶于 800ml 蒸馏水中，用盐酸调 pH值为7. 4,蒸馏水定容至1000ml，12rC高压灭菌20min，室温保存。
[0026] OptiMEM低血清培养基购自Gibco公司，货号：22600-134,批号：1448571.按说明 书进行配置后，PH值为7. 1左右，0. 2 μ m正压滤膜过滤除菌。
[0027] 微载体 Cytodex-1 :购自 Amersham pharmacia Biotch AB，经无 Ca2+，Mg2+离子的 PBS缓冲液清洗并浸泡3h，所用浸泡的玻璃容器应提前用硅化剂处理，经121°C 25min冷却 后，4°C密封保存备用。使用前用37°C的细胞培养液清洗3遍。
[0028] 石圭化剂购自s i gma公司，货号SL-2。
[0029] CeIIiGen 生物反应器：购自 New Brunswick Scientific Co. LTD USA 生产，实施例 中采用生物反应器型号为CeIIiGen310,工作体积10L，溶氧（DO)和pH由压缩Air、0 2、NjP CO2 4种气体控制，采用斜叶式搅拌桨。
[0030] 本发明所用的PKK细胞为PK15细胞的克隆细胞，公开于中国专利申请号为 201410309694. 7。
[0031] 本发明所用猪圆环病毒 2 型 SH 株（Porcine Circovirus Type 2, strain SH)，在 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏日期：2008年3月4日，保 藏号为CGMCC No. 2389,公开于中国专利CN101240264A。
[0032] 本发明实施例中，传代细胞使用了 PKK，其他本领域常用的传代细胞如RK细胞（兔 肾细胞）、Vero细胞（非洲绿猴肾细胞）、ST细胞（猪睾丸细胞）、Dulac细胞（猪肾细胞）， 也可用于本发明之方法大规模生产PCV2病毒或疫苗。
[0033] 本发明所述方法中，在病毒吸附阶段与病毒培养阶段，启动了病毒吸附程序与病 毒培养程序，本发明实施例中优化了反应器的控制参数，但本发明方法不仅限于实施例中 的参数，本领域技术人员可以根据本发明提供的技术启示，根据不同的生物反应器，调整相 应的参数，达到微载体与细胞充分结合后，大量扩增细胞及病毒的目的。
[0034] 实施例1
[0035] 大规模高滴度猪圆环病毒2型的增殖
[0036] 1细胞的培养
[0037] 复苏PKK细胞，用Gibco公司的OptiMEM低血清培养基不额外添加血清培养PKK 细胞，37°C 5% CO2培养箱培养48~72h，胰蛋白酶消化后制成细胞悬液，按一定的分散比 例进行传代并逐步扩大传代至转瓶中培养，为生物反应器内提供种子细胞。
[0038] 2病毒的培养
[0039] 生物反应器工作体积为10L，微载体浓度为10g/L。采用同步接毒法，即PKK细胞 在转瓶中培养形成良好致密单层，胰蛋白酶消化后制备成细胞悬液，接种细胞悬液到已硅 化处理过的含微载体的生物反应器中，接种的细胞密度为5X IO5个/ml。
[0040] 同步接种圆环病毒PCV-SH株，接毒剂量按Μ. 0.1 . = 0. 2,补加3000ml OptiMEM低 血清培养基。接毒后采用搅拌30min，停止15min的方法周期间歇性的搅拌维持2h促进细 胞贴壁与病毒结合，2h后补加 OptiMEM低血清培养基至生物反应器工作体积10L。生物反应 器设置参数为DO为50%，搅拌转速65rpm，采用压缩Air、O 2、N2和CO2四气模式条件培养。
[0041] 3病毒的收获
[0042] 同步接毒72h进行收毒，每天收获1个体积，并补加等体积的OptiMEM低血清培养 基，连续收获5天。收毒期间每天监测葡萄糖含量。
[0043] 4病毒滴度的测定
[0044] 对收获的病毒液分别间接免疫荧光法测定病毒含量：取待测病毒液做十倍系列 稀释，接入96孔细胞培养板，100 μ L/孔，同时接种PKK细胞2. OX IO4/孔cell，然后让细 胞培养板置于37°C，5% CO2培养5日，进行荧光染色判定。出现荧光的及判定该孔细胞感 染，按R-M法计算TCID5。。连续收获5天的病毒液病毒含量均在10，CID5(]/ml以上。
[0045] 5纯净性检验
[0046] 按《中华人民共和国兽药典》2005版附录15、19、20页相关规定进行检验，结果无 细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。
[0047] 实施例2
[0048] 添加 D-氨基葡萄糖条件下猪圆环病毒2型增殖情况比较
[0049] 1细胞的培养
[0050] 复苏PKK细胞，用Gibco公司的OptiMEM低血清培养基不额外添加血清培养PKK 细胞，37°C 5% CO2培养箱培养48~72h，胰蛋白酶消化后制成细胞悬液，按一定的分散比 例进行传代并逐步扩大传代至转瓶中培养，为生物反应器内提供种细胞。
[0051] 2病毒的培养
[0052] 生物反应器工作体积为10L，微载体浓度为10g/L。采用同步接毒法，即PKK细胞 在转瓶中培养形成良好致密单层，胰蛋白酶消化后制备成细胞悬液，接种细胞悬液到已硅 化处理过的含微载体的生物反应器中，接种的细胞密度为5X