H9亚型禽流感重组鸭肠炎病毒rDEVΔUL2-H9株的构建及其应用

文档序号:9628050阅读:1026来源:国知局
H9亚型禽流感重组鸭肠炎病毒rDEVΔUL2-H9株的构建及其应用
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及H9亚型禽流感重组鸭肠炎病毒rDEV Δ UL2-H9株的构建及其应用,属 于病毒学和兽用生物制品领域。
【背景技术】
[0002] 鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus, DEV),又名鸭痕病毒(Duck Plague virus), 可感染鸭、鹅及其它雁形目禽类,引起血管损伤、组织出血、消化道粘膜损伤、淋巴器官受 损和实质性器官退行性病变的一种急性、接触性、败血性传染病--鸭病毒性肠炎(Duck viral enteritis, DVE),或称鸭痕(Duck plague, DP) (Sandhu and Metwally, 2008)。自 1923年被首次发现以来(Baudet,1923),本病相继发生于法国、印度、比利时、英国、泰国和 加拿大等国家(殷震和刘景华,1997),流行范围、感染禽类的种类有逐步扩大的趋势,至少 48种雁形目中的禽类对DEV易感(Kaleta et al.,2007)。鸭瘟是一种广泛嗜全身性感染 的传染病,发病率和死亡率都很高,给水禽养殖业带来巨大损失。免疫接种是预防和控制该 病暴发的重要措施,目前我国用于鸭瘟预防的疫苗主要是上世纪60年代研究成功的鸡胚 弱化活疫苗。DEV具有良好的免疫原性,免疫力产生快速,免疫后3天便可抵抗鸭瘟强毒攻 击;免疫期长,可达一年。
[0003] DEV属于痕疼病毒科、甲型痕疼病毒亚科、马立克病毒属、鸭痕疼病毒1型 (http://www. ictvonline. org)。李玉峰应用Shot-gun方法首次完成了 DEV--我国鸭 瘟商品化疫苗(DEV VAC)的全基因组测序。DEV VAC基因组全长为158, 089bp,G+C含量 为44. 91%,由长独特区(Unique Long, UL)和短独特区(Unique Short, US)组成,US区两 端为一对反向重复序列,分别称为内部重复序列(Internal R印eat, IR)和末端重复序列 (Terminal R印eat, TR)。基因组结构为UL-IR-US-TR,呈典型的D型疱疹病毒基因组结构 (Li et al.,2009)。我们完成了我国鸭肠炎病毒强毒参考株全基因组序列测定,该毒株基 因组全长为162,131bp,共78个0RF,编码76个蛋白(Yang et al.,2014)。与DEV CSC相 比,鸡胚连续传代致弱株DEV K p63基因组短4040bp,在UL区的5'端连续缺失3, 513bp导 致UL56移框突变,以及3'端连续缺失528bp导致UL2缺失176个氨基酸。DEV CSC UL2编 码了一个 HSV-1 同源物--尿啼啶 DNA 糖基化酶(uracil DNA glycosylase,UNG)。UNG 是 一个普遍存在的极保守的DNA修复酶。与DEVCSC相比,DEV K p63UL2在65位氨基酸后缺失 176aa,导致缺少前3个结构基序而不能形成HSV-1UL2相似的3D结构(Savva et al.,1995) 和活性中心(Arnold et al.,2006 ;Bordoli et al.,2009 ;Guex and Peitsch, 1997 ;Guex et al.,2009;Schwede et al.,2003)。研究表明,UL2对HSV-I在细胞培养中的正常复制 是非必需的,但对病毒在神经元中的复制具有重要作用。通过同源重组的方法,构建了缺失 UL2的HSV-I突变体,小鼠颅内直接接种后,其神经毒力比亲本毒低10倍,而外周途径接种 后神经毒力低100, 〇〇〇倍(Pyles and Thompson, 1994)。DEV UL2基因是否具有HSV-I相 似的功能,有待进一步研究。
[0004] 自1994年在我国广东某鸡场分离到H9N2亚型禽流感病毒以来,该亚型病毒在我 国的鸡、鸭、鹅等禽类中广泛流行,一直呈上升趋势,对鸭致病性逐渐增强,可引起蛋鸭产蛋 量下降,沙壳蛋增多,使雏鸭出现呼吸道症状和亚临床症状,此外,还可引起免疫抑制,造成 鸭群继发大肠杆菌等疾病,对养鸭也造成重大经济损失。
[0005] 随着基因工程技术的发展,重组病毒活载体疫苗成为当前新型疫苗研究的热点。 利用基因工程技术,将外源DNA插入到病毒基因重组,利用病毒表达外源DNA蛋白,制备成 一种活载体疫苗。这种疫苗可以同时启动机体细胞和体液免疫,可以通过一次免疫预防多 种疾病,降低了生产成本,简化了免疫程序,还能克服不同病毒弱毒疫苗之间的干扰现象。
[0006] 本发明通过同源重组技术,构建了一株缺失UL2基因196-723位核苷酸、带有GFP 标记的重组鸭肠炎病毒rDEV Δ UL2-GFP株,然后应用绿色荧光蛋白负筛选技术,获得了表 达H9亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因的重组鸭肠炎病毒rDEV Δ UL2-H9株。该重组病毒 免疫鸭后,能抵抗DEV强毒株的攻击,还能诱导较高的H9HI抗体。

【发明内容】

[0007] 本发明的目的在于提供一种表达H9亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因的重组鸭肠 炎病毒,即本发明先构建了一株缺失UL2基因、携带绿色荧光蛋白基因(GFP)标记的重组鸭 肠炎病毒rDEV △ UL2-GFP株,然后应用绿色荧光蛋白负筛选技术,获得了表达H9亚型禽流 感病毒HA基因的重组鸭肠炎病毒rDEV Δ UL2-H9株。将重组鸭肠炎病毒rDEV Δ UL2-H9株 制备成活疫苗,可预防鸭瘟和H9亚型禽流感。
[0008] 本发明的技术方案
[0009] 1. 一株重组鸭肠炎病毒,其特征在于该毒株为鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus,DEV)rDEVAUL2-H9株,该病毒株已于2015年11月11日送交北京市朝阳区北辰西 路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保 藏,保藏编号为=CGMCC No. 11497
[0010] 2.如权利要求1所述一株重组鸭肠炎病毒,其特征在于该鸭肠炎病毒 rDEV Δ UL2-H9株的UL2基因内插入了 H9亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因。
[0011] 3.如权利要求1所述一株重组鸭肠炎病毒的应用,其特征在于该毒株作为疫苗生 产毒株用于制备H9亚型禽流感-鸭肠炎病毒二联活疫苗,预防H9亚型禽流感和鸭瘟。
[0012] 4.如权利要求3所述一株重组鸭肠炎病毒的应用,其特征在于是将该株病毒接种 长满单层的无特定病原鸡的鸡胚成纤维细胞,收获病毒培养物,加适宜稳定剂,经冷冻真空 干燥制成所述H9亚型禽流感-鸭肠炎病毒二联活疫苗。
[0013] 5.如权利要求1所述一株重组鸭肠炎病毒的应用,其特征在于该株病毒缺失了 UL2基因196-723位核苷酸,可在此区域插入H5亚型禽流感病毒或/和鸭肝炎病毒或/和 鸭黄病毒保护基因并获得稳定、高效表达,制备成鸭肠炎病毒为载体的联合活疫苗。
【具体实施方式】
[0014] 1.重组病毒构建
[0015] 本发明所述的重组病毒为表达H9亚型禽流感病毒HA基因的鸭肠炎病毒 rDEV Δ UL2-H9株,该病毒构建方法如下:
[0016] ⑴载体
[0017] PMD-18T载体,用于克隆测序及转移载体的构建,购自宝生物工程(大连)有限公 司。含有CMV启动子、polyA的GFP报告基因载体pT-GFP-gpt (见图1),由本发明人所在实 验室构建、保存。
[0018] ⑵引物设计
[0019] 根据GenBank上发表的DEV序列设计合成以下引物:
[0020] 表1本发明构建所涉及的相关引物信息
[0023] (3)含GFP标记的鸭肠炎病毒rDEV Δ UL2-GFP的构建
[0024] 1)转移载体 pT-UL2-GFP-gpt 的构建
[0025] 以鸭肠炎病毒基因组DNA(AV1221)为PCR扩增模板,以引物UL2-uF、UL2-UR扩增 UL2基因的左端1185bp片段。以引物UL2-d、UL2-dR扩增UL2基因的右端1302bp片段。扩 增目的片段分别连接PMD-18T载体,构建相应的重组质粒pT-UL2u和pT-UL2d。用Sail和 HindIII双酶切上述重组质粒,分别回收3800bp和1302bp片段,获得重组质粒pT-UL2ud。 将重组质粒pT-UL2ud用Sail酶切,电泳回收后去磷酸化;pT-GFP-gpt用Sail酶切,电泳 回收2. Ikb片段,将GFP-gpt表达盒插入到pT-UL2ud中,获得转移载体pT-UL2-GFP-gpt。
[0026] 2)同源重组
[0027] 按照Lipofectamine?2000转染试剂盒(Invitrogen公司)说明书,将转移载体 pT-UL2-GFP-gpt与DEV进行转染鸡胚成纤维细胞(CEF)。具体步骤如下:
[0028] 六孔板中的CEF培养至长成70%~90%细胞单层时,接种适量的DEV,吸附1~ 4小时;将1 μ g转移载体稀释于不含血清和抗生素的opti-DMEM中,使混合液的终体积 均为50 yL,室温孵育5min;取2 yL Lipofectamine 2000与48 yL不含血清和抗生素的 opti-DMEM轻轻混匀,室温孵育5min ;将50 μ L Lipofectamine 2000稀释液分别滴加到 50yL质粒稀释液中,边加边混匀;室温孵育20min。在此期间,将六孔板中的细胞用无血 清OPTI-MEM轻轻洗两遍后,每孔加入0. 5mL无血清0ΡΤΙ-ΜΕΜ,将100 μ L Lipofectamine 2000/DNA复合物逐滴加入到6孔板中,轻轻摇动使其均匀混合,置37°C培养4h,弃去上清, 加入10%胎牛血清的[99培养基,置37°(:培养2411后,用1%胎牛血清的[99培养基换 液,置37°C培养3~5d,每天观察,直至出现重组病毒荧光斑。
[0029] 3)重组病毒的蚀斑纯化
[0030] 将初步获得的重组病毒接种已长成良好细胞单层的6孔板CEF细胞,吸附1小时 后,弃去吸附液,铺上1 %的低熔点琼脂糖,继续培养。接种48小时后在荧光显微镜下观察 绿色荧光,挑选单个荧光蚀斑于0. 5ml M199营养液中,冻融1次后接种6孔板CEF细胞,如 此进行蚀斑纯化3~4次,将获得的重组病毒命名为rDEV Δ UL2-GFP。
[0031] 4)重组病毒rDEV Δ UL2-GFP的鉴定
[0032] 采用ORF C17F、0RF C17R引物进行PCR扩增鉴定,PCR产物测序证实,重组病毒缺 失了 UL2基因,并成功插入了 GFP标记基因(见图2)。
[0033] 5)重组病毒rDEV Δ UL2-GFP的应用
[0034] 该株病毒缺失了 UL2基因196-723位核苷酸,可在此区域插入H5亚型禽流感病 毒、鸭肝炎病毒等的保护基因并获得稳定、高效表达,制备成鸭肠炎病毒为载体的联合活疫 苗。
[0035] (4) H9亚型禽流感病毒HA基因的重组鸭肠炎病毒(rDEV Δ UL2-H9)的构建
[0036] 重组病毒rDEV Δ UL2-GFP缺失了 UL2基因196-723位核苷酸,可在此区域插入H5 亚型禽流感病毒HA基因(序列9)获得重组病毒。
[0037] 1)转移载体PT-UL2-H9的构建
[0038] 根据GenBank公布的鸭源H9亚型禽流感病毒HA基因序列(序列10),人工合成HA 基因,以H9NheI-F和H9BHI-R引物RT-PCR扩增HA基因。将目的片段连接pMD-18T载体,构 建重组质粒PT-H9NBH。分别用NheI和BamHI双酶切重组质粒pT-UL2-GFP-gpt和pT-H9NBH, 分别回收6. Okb片段和I. 6kb片段,并将两片段连接,获得重组转移载体pT-UL2-H9。
[0039] 2)同源重组
[0040] 按照Lipofectamine?2000转染试剂盒说明书,将转移载体pT-UL2-H9与 rDEV AUL2-GFP病毒进行转染鸡胚成纤维细胞(CEF)。具体步骤如下:
[0041] 六孔板中的CEF培养至长成70 %~90 %细胞单层时,接
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