列 5)
[0034] EGFP-R :5' -GACTAGTGAGCTCTTAAAGCTCATCAT-3'（序列 6)
[0035] (4)US9 基因：
[0036] PUS9-F :5' -AGAAACCGGAAGTGACGAATGG-3'（序列 7)
[0037] PUS9-R :5' -AGGAGCACCTGGTCGCAGAG-3'（序列 8)
[0038] (5)UL49. 5基因（扩增含37_40aa基因片段）：
[0039] PUL50F :5' -GCCTGCAAGATGTAGCCGGAGA-3'（序列 9)
[0040] PUL50R :5' -TGGCGAGCGAGTGGGGTC-3'（序列 10)
[0041] (6)缺失Λ 37-40aa基因的UL49. 5部分基因（引入AflII酶切位点，用于UL49. 5 基因的连接）：
[0042] rPUL50F2 :5' -TAAGCTTGCCTGCAAGATGTAGCCGGAGA-3'（序列 11)
[0043] rPUL50R2 :5' -ACTTAAGTTAGGCGTAACCCAGGGCgAC-3'（序列 12)
[0044] (7)UL49. 5基因（扩增缺失了 CT的UL49. 5部分基因片段）：
[0045] rPUL49F :5' -TACTAGTAGATCGATCCGCACGCGC-3'（序列 13)
[0046] rPUL49R :5' -AGAATTCGCAGCGTGGACACGAAG-3'（序列 14)
[0047] rPUL49F2 :5' -ACTTAAGATCGATCCGCACGCGC-3' (引入 AflII 酶切位点，用于 UL49. 5 基因的连接）（序列15)
[0048] (8)UL49. 5基因左同源臂：
[0049] UL50F :5' -TAAGCTTGCCTGCAAGATGTAGCCG-3'（序列 16)
[0050] UL50R:5' -ACTTAAGTTAGGCGTAACCCAG-3，（序列 17)
[0051] (9)UL49. 5基因右同源臂：
[0052] UL48F:5' -TACTAGTAGATCGATCCGCACGCGCCCG-3，（序列 18)
[0053] UL48R:5' -AGAATTCGCAGCGTGGACACGAA-3'（序列 19)
[0054] (10) TK基因左同源臂：
[0055] UL24F :5' -GGTATACCCGTGGTCGTCACGCCCATGAA-3'（序列 20)
[0056] UL24R :5' -G GTATACATGCGCATCCCGGCGCGCTTC-3'（序列 21)
[0057] (11) TK基因右同源臂：
[0058] UL22F :5' -GACTAGTATGCCCGCGTCGTCCGTGCGC-3'（序列 22)
[0059] UL22R :5' -GACTAGTGCGGTACGCCTCGGCGACGGT-3'（序列 23)
[0060] (12) RFP 基因：
[0061] RFP-F :5' -GGTATACATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3'（序列 24)
[0062] RFP-R :5' -GACTAGTTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3'（序列 25)
[0063] 3.含GFP标记的伪狂犬缺失病毒（rPRV/gE /gl /US9 /GFP+)的构建
[0064] (1)转移载体 pMD-US6-GFP-US2 的构建
[0065] 以PRV SX株（中国兽医药品监察所由山西某猪场采集的病死猪脑组织病料中自 主分离、鉴定而获得，图1、2)的基因组为模板，采用引物US6F/R(序列1、2)和US2F/R(序 列3、4)分别扩增gE、gl、US9缺失的同源重组左同源臂和右同源臂；以pU-EGFP为模板，用 引物EGFP-F/EGFP-R(序列5、6)扩增GFP基因。扩增目的片段分别连接pMD-18T载体，构 建相应的重组质粒。以Sbfl/Aflll双酶切左臂，以Spel/EcoRI双酶切右臂，回收相应片段 后依次与PMD-GFP质粒相应酶切后的片段连接，获得转移载体pMD-US6-GFP-US2。
[0066] ⑵同源重组
[0067] 将转移载体PMD-US6-GFP-US2与PRV (SX株）亲本株共转染PK15细胞，按照 Lipofectamine?2000转染试剂盒说明书（见附件1)进行转染。转染24小时后，观察细胞 病变及荧光蛋白表达情况。转染细胞裂解后盲传两代，仍有绿色荧光表达，初步判断重组病 毒拯救成功。
[0068] (3)重组病毒的蚀斑纯化
[0069] 将初步获得的重组病毒接种已长成良好细胞单层的PK15细胞6孔细胞板，吸附 1小时后，弃去吸附液，铺上1 %的低熔点琼脂糖，继续培养。接种48小时后在荧光显微镜 下观察绿色荧光，挑选单个荧光蚀斑于ImlDMEM营养液中，冻融1次后，如此进行蚀斑纯化 3~4次，将获得的重组病毒命名为rPRV/gE /gl /US9 /GFP+。
[0070] (4)重组病毒 rPRV/gE /gl /US9 /GFP+的鉴定
[0071] 采用gE、gI、US9和GFP基因特异性引物进行PCR扩增鉴定，结果发现未扩增出gE、 gl和US9片段，扩增出GFP片段。经测序证实，重组病毒缺失了 gE、gI和US9三段基因，并 成功插入了 GFP标记基因。
[0072] 4.伪狂犬病病毒双荧光标记缺失病毒（rPRV/gE /gl /US9 / Λ UL49. 5/GFP+/RFP+) 的构建
[0073] (1)转移载体的构建
[0074] 通过基因克隆技术以PRV(SX株）UL49.5基因为模板，构建两个克隆载体 PMD18T- Λ 37 ~40 和 pMD18T-CT-null (序列 11、12、13、14、15、16、17、18、19)，分别缺失 UL49. 5中胞外域37~40氨基酸基因序列和胞质尾区（CT) 80~96氨基酸，并将缺失了这 两部分的基因片段通过引入酶切位点Af III进行连接，构建含有CT基因两端部分基因序列 的同源臂的转移载体 PMD-UL50-UL49. 5- Λ 37 ~40-CT-RFP-PU49。
[0075] (2)同源重组
[0076] 将rPRV/gE /gl /US9 /GFP+病毒和上述转移载体共转染ΡΚ15细胞，按照 Lip〇fectamineTM2000转染试剂盒说明书进行转染。转染24小时后，观察细胞病变及荧光 蛋白表达情况。转染细胞裂解后盲传两代，仍有绿色和红色双色荧光表达，初步判断重组病 毒拯救成功，获得缺失gE、gl、US9、部分UL49. 5基因（37~40氨基酸基因序列和CT基因 序列）的缺失病毒 rPRV/gE /gl /US9 / Λ UL49. 5/GFP+/RFP+。
[0077] 再通过同源重组将RFP缺失，最终筛选出rPRV/gE /gl /US9 / Λ UL49. 5/GFP+缺失 病毒。
[0078] (3)重组病毒的蚀斑纯化
[0079] 将初步获得的重组病毒接种已长成良好细胞单层的PK15细胞6孔细胞板，吸附1 小时后，弃去吸附液，铺上1 %的低熔点琼脂糖，继续培养。接种48小时后在荧光显微镜下 观察绿色荧光，挑选单个荧光蚀斑于Iml DMEM营养液中，冻融1次后，如此进行蚀斑纯化 3~4次，将获得的重组病毒命名为rPRV/gE /gl /US9 / Λ UL49. 5/GFP+。
[0080] (4)重组病毒 rPRV/gE /gl /US9 / Λ UL49. 5/GFP+的鉴定
[0081] 采用gE、gI、US9、UL49. 5和GFP基因特异性引物进行PCR扩增鉴定，结果发现未扩 增出gE、gl和US9片段，扩增出缺失了相应大小片段的UL49. 5,扩增出GFP片段。并经测 序证实，重组病毒缺失了 gE、gl、US9、UL49. 5的37~40氨基酸对应的核苷酸和CT基因， 并含有GFP标记基因。
[0082] 5.伪狂犬病病毒双荧光标记缺失病毒株（rPRV/gE /gl /US9 / Λ UL49. 5/TK / GFP+/RFP+)的构建
[0083] (I)转移载体的构建
[0084] 以PRV SX株的基因组为模板，采用引物UL24F/R(序列20、21)和UL22F/R(序 列22、23)分别扩增TK缺失的同源重组左同源臂和右同源臂；以pU-RFP为模板，用引物 RFP-F/RFP-R(序列24、25)扩增RFP基因。扩增目的片段分别连接pMD-18T载体，构建相应 的重组质粒。以SbfI/BstZ17I双酶切左臂，以Spel/EcoRI双酶切右臂，回收相应片段后依 次与pMD-RFP质粒相应酶切后的片段连接，获得转移载体pMD-UL24-RFP-UL22。
[0085] (2)同源重组
[0086] 将转移载体 pMD-UL24-RFP-UL22 与 rPRV/gE /gl /US9 / Λ UL49. 5/GFP+共转染 PK15细胞，按照Lipofectamine?2000转染试剂盒说明书进行转染。转染24小时后，观察 细胞病变及荧光蛋白表达情况。转染细胞裂解后盲传两代，仍有绿色和红色双色荧光表达， 初步判断重组病毒拯救成功。
[0087] (3)重组病毒的蚀斑纯化
[0088] 将初步获得的重组病毒接种已长成良好细胞单层的PK15细胞6孔细胞板，吸附 1小时后，弃去吸附液，铺上1 %的低熔点琼脂糖，继续培养。接种48小时后在荧光显微 镜下观察荧光，挑选同时表达了绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的单个荧光蚀斑于ImlDMEM 营养液中，冻融1次后，如此进行蚀斑纯化4次，将获得的重组病毒命名为伪狂犬病毒 (Pseudorabies virus，PRV)rPRV/gE /gl /US9 / Λ UL49. 5/TK /GFP+/RFP+株（简称伪狂犬 病毒双荧光标记5基因缺失株），该株病毒已于2015年11月11日送交北京市朝阳区北辰 西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 保藏，保藏编号为=CGMCC No. 11493。
[0089] (4)重组伪狂犬病病毒 rPRV/gE /gl /US9 / Λ UL49. 5/TK /GFP+/RFP+株的鉴定
[0090] 采用gE、gI、US9、GFP、UL49. 5、TK和RFP基因特异性引物进行PCR扩增鉴