一种以木质素磺酸盐作为诱导剂提高栓菌产酶的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种以木质素磺酸盐作为诱导剂提高栓菌产酶的方法，属于微生物发酵技术领域。
【背景技术】
[0002]微生物发酵技术通常是生产单一酶制剂，实际应用中又常常将几种酶复配后应用，但各种酶的复配有可能会影响彼此的酶学性质，因此，发酵液含多种酶的体系能得到更好的应用。
[0003]中国专利公布号CN102268379A，公布日2011年12月07日，发明名称为“一种毛栓菌及其产纤维素酶的方法”，该发明公开了毛栓菌发酵产纤维素酶的方法，成功测得纤维素酶酶活，该发明的不足之处在于粗酶液中仅含一种酶且未添加诱导剂。
[0004]中国专利公布号CN1023509764A，公布日2014年01月15日，发明名称为“一种应用于栓菌固态发酵产漆酶的培养基”，该发明公开了一种栓菌固态发酵产漆酶的培养基，该发明的不足之处在于主要产漆酶，未涉及多酶体系，且未添加诱导剂。
[0005]因此，筛选得到一株能产多种酶的菌株是亟需解决的问题。
[0006]本发明筛选到一株可同时产漆酶、纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶的菌株，但是发酵粗酶液酶活还有待提高，以便于工业化应用。已有报道显示，在生物发酵技术中添加诱导剂可加强微生物的产酶能力，提高粗酶液酶活，藜芦醇、愈创木酚和苯甲醇对漆酶的分泌都具有诱导作用。如何在同一发酵体系中，同时提高漆酶、纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶的产量，也是亟需解决的问题。
【发明内容】
[0007]为了解决上述问题，本发明提供一种提高栓菌产酶的方法，所述方法是以木质素磺酸盐作为诱导剂，是在栓菌的培养基中添加木质素磺酸盐。
[0008]在本发明的一种实施方式中，所述栓菌为Trametes sp.LEF01，于2015年5月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏号为CGMCCN0.10489。
[0009]在本发明的一种实施方式中，所述栓菌CGMCC N0.10489是从土壤中分离得到的。
[0010]在本发明的一种实施方式中，所述栓菌CGMCC N0.10489可产漆酶、纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶，在以马铃薯提取液和葡萄糖为主要原料(马铃薯液体培养基)进行振荡培养发酵产酶，发酵产酶酶活可达:漆酶酶活630.6U/L，纤维素酶酶活1108.9U/L，半纤维素酶酶活3844.9U/L，果胶酶酶活520.7U/L。
[0011]在本发明的一种实施方式中，所述木质素磺酸盐为木质素磺酸钠。
[0012]在本发明的一种实施方式中，所述木质素磺酸盐的添加量为0.5_4g/L。
[0013]在本发明的一种实施方式中，所述木质素磺酸盐的添加量为0.8-lg/L。
[0014]在本发明的一种实施方式中，所述培养基为马铃薯液体培养基。
[0015]在本发明的一种实施方式中，所述方法是将栓菌CGMCC N0.10489活化后，接入含有木质素磺酸盐的马铃薯液体培养基中，在28°C、150rpm的条件下振荡培养6天，离心取上清即得粗酶液。
[0016]在本发明的一种实施方式中，所述马铃薯液体培养基的制备方法??每L的配方，取去皮马铃薯200g、切块、煮沸、过滤，然后补足至1L，并加入20.0g葡萄糖。
[0017]在本发明的一种实施方式中，所述方法具体是:称取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1.0L煮沸20?30min，4层纱布过滤滤去马铃薯块，将滤液补足至1.0L，加入20.0g葡萄糖，加入lg木质素磺酸盐；分装后121°C高压灭菌20?30min后，冷却，无菌操作，接入在PDA斜面培养基上已培养5?6天的CGMCC N0.10489菌株的菌悬液，在恒温振荡培养箱内28?30°C条件下振荡培养6天，转速为150rpm，发酵结束，发酵液4000rpm离心30min，得到的上清液为粗酶液。
[0018]本发明还要求保护按所述方法得到的粗酶液，以及其在纺织领域的应用。
[0019]本发明的有益效果:
[0020](1)本发明的栓菌培养基使用原料为马铃薯、葡萄糖、木质素磺酸盐，来源广泛，发酵液对环境无污染；
[0021](2)本发明通过使用栓菌CGMCC N0.10489，使发酵液中含有多种酶制剂。
[0022](3)通过在培养基中添加诱导剂木质素磺酸盐，可以使漆酶、纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶的酶活同时得到显著提高，漆酶酶活可提高至4-7倍、纤维素酶酶活提高至2倍、半纤维素酶酶活提高至4-6倍、果胶酶酶活提高至32-38倍。
[0023](4)按本发明方法，得到的粗酶液中漆酶酶活4100.8U/L，纤维素酶酶活2310U/L，半纤维素酶酶活21271.8U/L，果胶酶酶活19800U/L。
[0024]生物材料保藏:
[0025]—种栓菌，分类学命名为栓菌Trametes sp.，于2015年5月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏号为CGMCC N0.10489，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
【具体实施方式】
[0026]酶活测定方法:
[0027](1)漆酶酶活
[0028]定义:lmin内氧化ABTS生成1 μπιο? ABTS自由基所需酶量为1个酶活单位。
[0029]测定方法:以ABTS (2，2’ - 二氮-双(3-乙基苯并噻唑_6_磺酸)铵盐)为底物测定漆酶酶活，即取2mL 0.5mmol/L ABTS溶液(用ρΗ5.0，浓度为0.05mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液配制)，空白样用等量缓冲溶液替代，37°C预热，加入lmL粗酶液，测定420nm处吸光度变化率。漆酶酶活=吸光度变化率X反应液体积X1000X稀释倍数/摩尔吸光数
[0030](2)纤维素酶酶活
[0031]定义:lmin内产生1 μπιο?葡萄糖所需的酶量为1个酶活单位。
[0032]测定方法:利用DNS法(3，5- 二硝基水杨酸法)测定纤维素酶酶活，即取0.2mL粗酶液，加入1.8mL质量分数0.625%羧甲基纤维素钠(CMC_Na)溶液(用pH为4.8,0.2mol/L醋酸-醋酸钠缓冲溶液配制)，空白样加入等量醋酸-醋酸钠缓冲溶液，于50°C反应30min后立即加入2mL DNS试剂，沸水浴lOmin显色，冷却，稀释定容至一定倍数，充分混勾，测定550nm处吸光度。纤维素酶酶活=葡萄糖浓度X反应液体积X 1000X稀释倍数/反应时间
[0033](3)半纤维素酶酶活
[0034]定义:lmin内产生1 μπιο?木糖所需的酶量为1个酶活单位。
[0035]测定方法:利用DNS法测定半纤维素酶酶活，即取lmL粗酶液，加入2mL质量分数为0.5%的木聚糖悬浮液(用pH4.8，浓度0.05mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液配制)，空白样加入等量醋酸-醋酸钠缓冲溶液，在60°C下处理30min后立即加入2mLDNS试剂终止反应，沸水浴lOmin显色，冷却至室温，稀释定容至适当体积，混合均匀后测定540nm处吸光度。半纤维素酶酶活计算方法为:根据木糖标准曲线得到木糖浓度，半纤维素酶酶活=木糖浓度X反应液体积X 1000 X稀释倍数/反应时间
[0036](4)果胶酶酶活
[0037]定义:lmin内使聚半乳糖醛酸催化裂解产生1 μmol不饱和半乳糖醛酸的酶量。
[0038]测定方法:以果胶为底物测定果胶酶酶活，即取lmL粗酶液，加入2mL 0.2%果胶的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(PH9.4)，空白样加入等量pH9.4的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，45°C水浴中反应15min，加入0.03mol/L的磷酸3mL，测定235nm处吸光值。果胶