一种利用多重pcr技术进行snp-单体型分析的方法

一种利用多重pcr技术进行snp-单体型分析的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学与生物信息学领域，具体涉及一种利用多重PCR技术进行 SNP-单体型分析的方法。
【背景技术】
[0002] 2014年世界卫生组织统计，出生缺陷大约在33个婴儿中影响1人，每年造成约 320万例与出生缺陷相关的残疾，每年估计有27万新生儿死于出生缺陷。出生缺陷可源自 遗传、传染或环境方面的因素，许多出生缺陷是可以预防的，例如单基因遗传病，做好充分 的孕前和产前筛查是关键。
[0003] 胚胎植入前诊断（PGD)技术是指在体外受精过程中，对具有遗传风险患者的胚胎 进行植入前活检和遗传学分析，以选择无遗传学疾病的胚胎植入宫腔，从而获得正常胎儿 的诊断方法，可从根源上阻断单基因遗传病的发生和传递，将出生缺陷的预防提前到胚胎 阶段。然而，单基因遗传病的PGD检测并未广泛应用，其原因主要是由于标本量少（仅几个 细胞），容易产生等位基因脱扣（ADO)和污染，检测较为困难，现有技术无法完全满足PGD检 测要求。
[0004] 胚胎植入前单体型分析是目前PGD检测技术的主要方法。该方法通过检测突变位 点和多个与其连锁的短串联重复序列（STR)或单核苷酸多态性（SNP)来确定突变连锁单体 型，降低了等位基因扩增不平衡、ADO及污染的影响。其中，多重荧光PCR技术结合多个STR 进行突变位点的单体型分析曾成为PGD检测连锁分析的主要技术方案，但是，STR连锁标记 较少，应用到具体案例中可能会没有可用STR位点，所以进行临床检测前需要做大量预实 验工作。而且，STR遗传标记大多距离致病位点较远，可能会由于染色体重组导致误诊。
[0005] 相反，SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500-1000个碱基对（bp)中就有1个， 估计其总数可达300万个甚至更多，且SNP不会发生STR中存在的多个核心序列重复、核心 序列的非整倍重复等现象，此外，SNP检测对DNA样本的要求更低、价格更加廉价。因此，这 种具备密度高、数量多、稳定性高并且高通量等特征的SNP标记，逐渐取代STR作为连锁分 析标记的首选。
[0006] 目前，检测遗传标记分型技术应用广泛的主要有多重荧光PCR(MF-PCR)、DNA芯片 技术（SNP-array)、利用探针捕获SNP(国际公布号W02015/042980)等，从一定程度上促进 了 SNP-单体型分析的发展。然而，上述各技术均存在一定的缺陷，例如多重荧光PCR技术 采用多重PCR结合荧光探针检测STR分型，由于STR标记较少，距离较远易重组，实践中可 用STR位点较少，检测成本较高，故此技术无法进行批量检测；而芯片和探针捕获SNP的方 法，与普通PCR捕获SNP方法相比较，成本偏高，周期偏长。

【发明内容】

[0007] 本发明所要解决的技术问题就是要克服现有技术中所存在的上述不足，提供一种 利用多重PCR技术进行SNP-单体型分析的方法，其操作简单、结果准确，能够缩短检测周 期、降低成本。
[0008] 本发明的目的通过以下技术方案实现：本发明提供了一种利用多重PCR技术进行 SNP-单体型分析的方法，具体步骤如下所述。
[0009] 1.根据目标区域设计引物
[0010] I. 1 确定目标基因，根据具体种属，以NCBI (National Center for Biotechnology Information)官方网站基因序列为参考序列确定目标基因所在染色体的具体位置，从而锁 定捕获区域。
[0011] 1 · 2 多重 PCR-SNP 设计
[0012] 1.2. 1选择SNP区域，界定在目的基因上下游IM范围内，杂合度较高（千份个体数 据库中频率大于〇. 3) ;SNP间距越小，重组率越小。
[0013] 1.2. 2 SNP区域捕获范围，在SNP位点上下游100bp，捕获片段大小为200bp左右。
[0014] 1. 2. 3引物设计：利用Oligo、Primer等引物设计软件或引物专业设计网站进 行引物设计，设计时尽量将各SNP位点引物的退火温度控制在较小范围内（如50-55°C、 53-58°C、55-60°C或50-60°C等范围），利于后面的PCR扩增，引物长度则控制在20-25bp左 右。
[0015] 1. 2. 4引物评估：引物设计完成后采用NCBI或UCSC等专业网站进行引物特异性 评估（如错配率、发夹结构等等），评估合格后进行引物合成，设计的所有引物在合成时等 摩尔比例合并为一管，利用后面扩增单管操作。
[0016] 2.家系样本及胚胎样本准备
[0017] 2. 1提取家系中患病个体、患病个体的父本以及母本的外周血样本，获得基因组 DNA0
[0018] 2. 2采集胚胎细胞样本，利用MALBAC技术完成胚胎细胞的全基因组扩增；其中，胚 胎细胞可以选自人或者其他哺乳动物。
[0019] 3.多重PCR扩增，对家系及胚胎样本进行目标区域SNP的捕获。
[0020] 将步骤1中设计的所有引物在合成时等摩尔比例合并为一管，作为单引物扩增， 一管操作，同时扩增几十甚至上百个SNP位点。采用touch down PCR扩增程序，覆盖多对 引物退火温度，提高扩增效率，最终可以达到90 %的覆盖度。
[0021] 对于多重PCR扩增的前期阶段，需进行预实验，主要通过以下几个方面进行优化：
[0022] a)根据设计所得引物退火温度，设置不同范围的touch down PCR，以提高扩增效 率。例如，某目的区域SNP位点引物退火温度大致范围在60-55Γ，则可以先以每个循环降 1°C，设置60-55Γ的退火温度范围。如果扩增后电泳条带显示有非特异带，或经步骤b)中 qPCR验证扩增效率不佳，此种情况下，可以选择每个循环降0. 5 °C，设置60-55 °C ;或者每个 循环降1°C，设置60-50 °C ;
[0023] b)对多重扩增产物进行qPCR验证，检测多重扩增中各个SNP位点引物的扩增效 率，对于反复验证扩增效率较低的引物进行替换；
[0024] c)设置不同梯度的模板量（例如50微升体系中，选择40、60、80、100、120、150ng 的模板梯度）进行扩增，找出扩增效率高的最低模板量，实现低模板量的多个SNP扩增；
[0025] d)基于普通PCR扩增，进行扩增体系优化，提高扩增效率。例如，扩增时，不用普通 DNA聚合酶，而采用热启动DNA聚合酶或高保真DNA聚合酶；dNTP和Mg2+相对比例优化；对 于GC含量较高的区域，加入某些增强剂等等。
[0026] 预实验成功后，进行家系及胚胎样本的扩增。对扩增产物进行纯化、建库、上机测 序，根据测序数据分析结果，进行SNP-单体型分析。
[0027] 4.高通量测序
[0028] 采用高通量测序平台，对样本进行测序。测序平台不受特别限制，第二代测序平 台：包括但不限于 Illumina 公司的 GA、GAII、GAIIx、HiSeq100 0/2000/2500/3000/4000、 X Ten、X Five、NextSeq500/550、MiSeq，Applied Biosystems 的 SOLiD，Roche 的 454FLX， Thermo Fisher Scientific(Life Technologies)的 Ion Torrent、Ion PGM、Ion Proton I/ II ;第三代单分子测序平台：包括但不限于Helicos BioSciences公司的HeliScope系统， Pacific Bioscience 的 SMRT 系统，Oxford Nanopore Technologies 的 GridlON、MinION0 测序类型可为单端（Single End)测序或双端（Paired End)测序。
[0029] 5.数据分析
[0030] 5. 1参考序列比对
[0031] 将测序结果去掉接头及低质量数据，比对到参考基因组。参考基因组可为全基 因组、任意染色体、染色体的一部分、基因。参考基因组通常选择已被公认确定的序列， 如NCBI或UCSC的基因序列为参考序列或任意一条染色体。比对软件可用任何一种免 费或商业软件，如 BWA(Burrows_Wheeler Alignment tool)、S0APaligner/soap2(Short Oligonucleotide Analysis Package)、Bowtie/Bowtie2〇
[0032] 5. 2 SNP calling
[0033] 用软件获得目标区域的SNP，软件包括但不限于samtools mpileup，GATK， FreeBayes，VarScan 中的至少之一。
[0034] 5. 3 SNP 过滤
[0035] SNP过滤，测序深度最低IOOX，等位基因杂合度差异最低10%，除去潜在错误的 SNP0
[0036] 5. 4筛选区分型SNP，并构建父本和母本SNP-单体型。
[0037] 区分型SNP，即同一 SNP位点，父本和母本的4个等位基因碱基中，有1个碱基不同 于其他3个即可区分。
[0038] 5. 5分析胚胎SNP-单体型
[0039] 胚胎SNP-单体型有2个，分别遗传自父本和母本