可用于检测与喉癌相关的esrrg基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用

文档序号:9628141阅读:1124来源:国知局
可用于检测与喉癌相关的esrrg基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种辅助诊断喉癌的检测试剂盒,尤其是涉及一种可用于检测与喉癌 相关的基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002] 喉癌(Laryngeal carcinoma,LC)是头颈部常见的恶性肿瘤之一,其发病率在我国 北方地区位于头颈部恶性肿瘤的第一位,在我国南方地区,仅次于鼻咽癌居于第二位:在世 界范围内,居于全身恶性肿瘤的第十一位,约占全球每年新发恶性肿瘤的1-2. 5%,其中喉鳞 状细胞癌约占90%。目前研究表明喉癌的发生发展与生活习惯、环境因素、遗传和表观遗传 学等多种复杂的因素相关。近年来,随着人们生活水平的提高,环境因素恶化等影响,我国 喉癌的发病率和死亡率增长迅速,而且发病年龄明显提前。由于喉癌的早期症状不明显,病 理学活检是其诊断的金标准,确诊时患者多数已进入中、晚期,许多患者在疾病发生的早期 没有得到及时的诊断和治疗,对喉癌的治疗和预后带来了极差的影响。尽管近几十年来外 科技术和辅助治疗得到不同程度的提高,但是目前喉癌的五年生存率仍未明显增长,原因 之一就是目前喉癌发病的分子学机制仍不清楚,早期诊断及治疗不理想。因此,有必要探索 具有高敏感性和特异性的分子检测指标,对喉癌患者做到早发现,早诊断,早治疗,提高喉 癌患者总体生存率。
[0003] 雌激素相关受体伽马(estrogen-related receptor gamma,方57况6)是雌激素 相关受体(Estrogen-related receptors,家族中的一员,定位于染色体lq41 (chrl:216676588-217311097),cDNA全长3. Okb,编码一条长458氨基酸多肽链。因其尚 未发现天然配体,故也称为孤核受体。雌激素相关受体可通过两个锌指结构组成的DNA结 合域,和其它转录因子之间相互作用或结合DNA序列上的反应元件,调控多种基因的转录, 参与细胞增殖、分化、凋亡、胞内信号传导、核内信号信息的交流等过程。最近国内外的一些 研究表明,通过上调雌激素相关受体伽马的表达可增加 E-钙黏蛋白表达,继而促进间质向 上皮转化,并在体内抑制乳腺癌的生长。同样,将雌激素相关受体伽马基因前体进转染入前 列腺癌细胞系LnCaP和DU145,可在体外显著抑制肿瘤增殖和在体内抑制肿瘤形成,表明 雌激素相关受体伽马(estrogen-related receptor gamma,j5157?y?ii)在多种肿瘤中起到抑癌 基因的作用。但是目前,国内外还没有公开任何关于在喉癌中用于检测雌激素相关受体伽 马基因启动子区甲基化程度的检测试剂盒相关研究报道。

【发明内容】

[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供一种检测方便、针对性强、检测准确率高的 可用于检测与喉癌相关的方5^6基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用,其中基因 方5^^甲基化水平与喉癌的患病率呈正相关,可通过对样品DNA甲基化水平测定辅助诊断 喉癌。
[0005] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:一种可用于检测与喉癌相关的 基因启动子区甲基化程度的试剂盒,包括基因启动子区的甲基化特异性扩增 上游引物、下游引物及其甲基化特异性测序引物,其中所述的甲基化特异性扩增上游引物 的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示: 5' -TAGAGTTAGAGGGAGATGAATTG-3' ; 所述的甲基化特异性扩增下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示: 5' -Biotin -TCTTTTCAAATCCATCACTAA -3' ; 所述的甲基化特异性测序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示: 5' -GGGAGATGAATTGGG _3'。
[0006] 上述可用于检测与喉癌相关的方5児?6基因启动子区甲基化程度的试剂盒的应用, 该试剂盒可用于喉癌辅助检测、诊断或药物治疗中。
[0007] 与现有技术相比,本发明的优点在于:本发明首次公开了可用于检测与喉癌相关 的方5^6基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用,所述的检测试剂盒包含雌激素相关 受体伽马基因启动子区的甲基化特异性上游引物、甲基化特异性下游引物及其甲基化特异 性测序引物。雌激素相关受体伽马基因启动子区域的高甲基化,影响转录因子与DNA间的 相互作用,或改变染色质结构从而导致雌激素相关受体伽马基因的低表达,从而影响喉癌 的发生和发展。因此,雌激素相关受体伽马基因启动子区甲基化水平与喉癌的患病率呈正 相关,通过检测雌激素相关受体伽马基因启动子区甲基化程度辅助诊断喉癌,简单、方便, 检测效率高,针对性强,具有准确可靠、灵活快速和经济节约的优点,有利于喉癌的早期发 现和及时治疗。
[0008] 综上所述,以基因处冗你启动子区域甲基化水平为基础的诊断试剂盒可以方便快 捷地在分子水平上实现对喉癌的检测,同时,以处冗你基因启动子区域DNA甲基化为靶点的 药物有望成为喉癌辅助诊断、检测和筛选的一种新手段。
【附图说明】
[0009] 图1为被检测序列所在区域(具体位置为chrl: 217311596-217311629),以及所检 测的6个CpG点之间的关联性分析结果(例如CpGl与CpG2的相关系数为0. 891,CpG2与 CpG3的相关系数为0.942); 图2为DNA甲基化水平检测结果示意图(如图示CpGl到CpG6的甲基化程度分别为66%, 64%,61%,61%,65%,66%);图中阴影部分显示的是对应CpG位点的信号强度,结合该位点附近 碱基种类可分析得到其甲基化水平(即阴影框对应的上方数字)。
【具体实施方式】
[0010] 以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。 具体实施例
[0011] 1、研究对象的收集 本研究选取宁波市某三甲医院手术切除的喉癌患者93例手术标本作为研究对象。所 有病例诊断,依据患者的临床资料、影像学和纤维喉镜镜检查等,并得到术后病理诊断确 认。手术切除喉癌组织和癌旁组织(距离癌组织至少5cm以上的正常组织)立即保存于-80 度液氮,用于日后组织标本全基因组DNA提取。所有研究对象都签署知情同意书。
[0012] 2、基因组DNA的提取 采用QIAamp DNAMini Kit (Qiagen, Hilden,德国)DNA提取试剂盒提取组织全基因 组DNA,再通过NanoDrop2000超微量分光光度计(美国,Thermo Fisher Scientific)检测 所得DNA的浓度,以供处冗你基因启动子区DNA甲基化水平的检测。
[0013] 3、DNA甲基化水平测定 本实验采用焦磷酸测序技术对方5^6基因启动子区的6个CpG位点(如图1)进行了 DNA甲基化水平分析。此技术的基本原理:用重亚硫酸盐处理DNA样品后,再应用聚合酶链 反应(PCR)扩增,可
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