Stmn2基因作为绵羊免疫性状的分子标记及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于绵羊分子标记制备技术领域，具体涉及一种STMN2基因作为绵羊免疫 性状的分子标记及其应用。本发明的分子标记克隆自STMN2基因。
【背景技术】
[0002] 在养羊业生产中，疾病严重威胁着羊只的健康并造成巨大的经济损失。尽管通过 加强饲养管理和应用药物疫苗等措施可预防疾病，但未能十分有效控制传染病的流行，同 时大量药物的使用会使动物机体产生耐药性，给畜产品的安全造成隐患。
[0003] 长远来看，从抗病力的遗传基础研究出发，筛选抗性基因，从分子水平开展抗病育 种，从遗传上提高羊只对病原的抗性，增强免疫力是从根本上解决这一问题的重要途径。抗 病育种潜在的巨大经济效益以及某些疾病可作为研究人类疾病动物模型的诱人前景，正有 力地推动着这项工作的发展。随着分子生物学、分子遗传学和基因工程技术的发展，抗病育 种在绵羊的育种中已经开始发挥重要作用。
[0004] 在抗病育种中，抗病基因的寻找是关键。目前国内外已鉴定出的主要抗病候选基 因有以下几个：
[0005] (1)天然抗性巨·结合蛋白 I (Natural resistance - associated macrophage protein I，Nrampl)，Nramp是一个基因家族，是目前研究较多的宿主抗性基因之一，至少包 括2~3个成员，现已发现有Nrampl和Nramp2。国内外学者对Nrampl基因与抗病力的相 关性进行了大量的研究，把Nrampl基因作为功能基因研究其结构与动物抗病性状的报道 也较多，但主要集中在人类、小鼠、猪和家禽上（陈冬金，谢喜平，陈岩锋，等.畜禽Nrampl 基因抗病作用的研究进展.畜牧与饲料科学，2012, 33(7) : 79 - 81.)。绵羊的Nrampl基 因定位在 1 号染色体 2q41 - q42 的区域（Pitel F. E. P. Cribiu，M. Yerle，et al. Regional localization of the ovine NRAMP gene to chromosome 2q41 - q42 by in situ hybridization. Cytogenet Cell Genet，1995, 70 (I-2) :116 ~118·)，山羊的 Nrampl 基因 定位于 2 号常染色体上长臂 ql2. 2 (Vacca G. Μ· M. Pazzola，C. Pisano，et al. Chromosomal localisation and genetic variation of the SLClIAl gene in goats(Capra hircus). Vet J，2011. 190(1) :60~65.)。研究发现，绵羊Nrampl基因多态性与伤寒沙门氏菌易感 性和抗性有关（姚菊霞，王光华，马利青.羊主要抗病候选基因的研究进展.青海畜牧兽医 杂志，2014, 44(5) :40~43.)。Nrampl蛋白可抵抗分枝杆菌、沙门氏菌等多种胞内寄生病 原菌的侵染而发挥重要的免疫功能，对畜禽机体抗病力影响较大（吴宏梅等，NRAMPl基因 研究进展及其在抗病育种中的应用.中国畜牧兽医，2005,32(4) :26~28.)。
[0006] (2)主要组织相容性复合物（MHC)是由一群紧密连锁的基因群组成的一个定位于 动物某对染色体的特定区域，与免疫应答和抗病性密切相关的多基因家族，在宿主的免疫 反应中对病毒、细菌、寄生虫的控制和清除有重要作用。目前，已证实主要组织相容性复合 物与人类和家畜的多种疾病存在着密切关系。因此，近年来对MHC的研究成为家畜抗病育 种研究中的前沿部分（孙东晓，张沅.反刍家畜主组织相容性复合物的研究进展.中国畜 牧杂志，2002,38(5) :46~47.h绵羊的MHC称为OLA(绵羊白细胞抗原），位于第20号染 色体上，具有高度的多态性和连锁不平衡性。根据MHC抗原结构和功能的不同，可将MHC分 为class I型class II型和class III型D -般认为绵羊MHC class II的多态性和遗传性是 为了保护机体组织对抗疾病的感染。在这个基因区域有DQ和DR两个亚区，OLA II类分子 的DQ和DR亚区的DRB和DQB两个基因位点所编码的MHC在抗原免疫系统中发挥着最主要 的作用；其第2个外显子编码抗原的功能区（抗原结合区）具有丰富的多态性，它组成II类 抗原分子功能最重要的部分。此外，MHC与生产性能具有密切的联系，但需要进一步研究才 能应用于家畜的遗传标记。
[0007] 此外，其它有研究的与抗病力有关的基因是TLR(Toll - like receptor，Toll 样受体）MX1 (Myxovirus (influenza)resistance 1，粘液病毒（流感）抗性因子 I)、 ILl(Interleukins 1，白细胞介素 I)、PPARG(Peroxisome proliferator activated receptor gamma，过氧化物酶体增殖激活受体γ)等基因 D
[0008] STMN2 (stathmin - like 2)蛋白，又称SCG10,是一种神经特异性蛋白，属于 stathmin家族，这个家族成员包括stathmin，STMN1，STMN2, SCLIP，RB3。在胚胎期神 经元发生的过程中生长锥部位表达含量很高（Grenningloh G，Soehrman S，Bondallaz P，et al. Role of the microtubule destabilizing proteins SCGlO and stathmin in neuronal growth. J Neurobiol，2004, 58(1) :60 ~69)，出生之后突然降低，但在成熟大 脑的神经元突触重塑部位仍有表达，这提示STMN2与神经结构重塑有着某种联系（Mori N j Morii H. SCGlO - related neuronal growth - associated proteins in neural dev elopment, plasticity, degeneration,and aging. J Neurosci Res，2002,70 (3):264 ~ 273)，Riedrer等研究表明STMN2的过度表达能促进神经的延伸（Riedrer Beat M，Pellier Yef Ronique，Antonsson Bruno,et al. Regulation of microtubule dynamics by the neuronal growth - associated protein SCG10. Neurobiology Proc Natl Acad Sci USA，1997, 94⑵：741~745)，从而导致突触的重塑，影响神经系统的可塑性（Hiroshi Morii，Tomiko YamadajItsuko Nakanoj et al. Site -specific phosphorylation of SCGlO in neuronal plasticity:Role of Ser73phosphorylation by N-methyld-aspartic acid receptor activation in rat hippocampus. Neuroscience Letters，2006,396 (3):241 ~ 246)。有研究发现，动物癫痫模型中STMN2的表达增高（Mori N，Morii H. SCGlO-related neuronal growth - associated proteins in neural development, plasticity, degen eration，and aging. J Neurosci Res，2002, 70 (3) : 264 ~273)，这表明其可能参与了难 治性癫痫的形成此外，有研究表明STMN2的激活与MPK(Mitogen actived protein kinase, MAPK)有关(Antonsson Bj Lutjens R，Di Paolo G，et al.Purification, char acterization，and in vitro phosphorylation of the neuron - specificmembrane -associated protein SCGlO.Protein Exp Purif，1997,9(3) :363 ~371)，而 MPK 信 号转导途径又广泛参与了神经系统多种疾病的病理过程。另外，最新研究报道指出， STMN2基因还参与肿瘤的发生等病理过程（Guo Q，Su N，Zhang J，et al. PAMkinase-mediated SCGIOphosphorylation involved in gastric cancer metastasis. Oncogene, 2014, 33 (25) : 3277 - 87) 〇
[0009] 通过以上资料我们可以得出STMN2基因参与动物神经系统疾病和肿瘤等的发生 和免疫调控。寻找基因中的变异位点，通过与性状间的关联分析发现基因与性状间的关系 是研究基因功能的一个重要手段，也是进行标记辅助选择的基础。为此开展了绵羊STMN2 基因完整cDNA序列的克隆和SNP筛查、检测及与免疫性状关联分析。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的在于克隆绵羊STMN2基因的完整CDNA序列，寻找STMN2基因的突变 位点以及基因的多态性的检测方法，提供适用于绵羊免疫性状的分子标记及在关联分析中 的应用。
[0011] 本发明通过以下技术方案实现：
[0012] 从绵羊STMN2基因片段中克隆得到一种作为绵羊标记辅助选择的与免疫性状相 关的分子标记，它的完整cDNA序列如序列表SEQ ID NO :1和图1所示，它的部分DNA序列 如序列表SEQ ID NO: 2和图2所示。在SEQ ID NO :2所示序列的第215位碱基处有一个G/ A碱基突变，该突变位于第4外显子内，该突变导致Tfi I - RFLP多态性。
[0013] 申请人设计了一对克隆绵羊STMN2基因完整cDNA的引物序列，该引物扩增的部分 cDNA序列如SEQ ID NO :1所述。同时申请人设计了一对包含第4外显子的用于扩增绵羊 STMN2基因组序列的引物，该引物扩增的序列如SEQ ID NO : 2所述。
[0014] 申请人提供了一种筛选上述分子标记的方法，所述的方法包括以下步骤：
[0015] 以成年湖羊瘤胃、脾脏、肾脏等组织总RNA为模板，进行RT - PCR扩增、PCR产物纯 化和克隆测序，进行序列分析，获得如序列表SEQ ID NO :1所述cDNA序列；从绵羊血液基因 组中提取DNA，设计引物，PCR扩增、PCR产物纯化、克隆和测序，获得如序列表SEQ ID NO :2 所示的核苷酸序列。
[0016] 应用常规的PCR -RFLP的方法对序列表SEQ ID NO :2的第215位碱基突变进行了 检测，并初步进行其基因型与绵羊免疫性状之间的关联分析的应用，为绵羊的分子标记辅 助选择提供了 一个新的分子标记。
【附图说明】
[0017] 序列表SEQ ID NO :1是本发明克隆的绵羊免疫性状相关基因 STMN2的完整cDNA 序列。序列长度为769bp。
[0018] 序列表SEQ ID NO :2是本发明克隆的绵羊免疫性状相关基因