采用修饰的环糊精的蛋白质检测的制作方法

文档序号:9634762阅读:706来源:国知局
采用修饰的环糊精的蛋白质检测的制作方法
【专利说明】采用修饰的环糊精的蛋白质检测
[0001] 相关申请的交叉参考
[0002] 本申请要求2013年8月9日提交的名为"采用修饰的环糊精的蛋白质检测 (PROTEIN DETECTION USING MODIFIED CYCLODEXTRINS)"的美国临时申请号61/864, 388 的 优先权,其全部内容通过引用纳入本文用于所有目的。
【背景技术】
[0003] 用于人类疾病治疗的许多现代疗法利用或靶向蛋白质。为了开发此类疗法,医师 和科研人员需要了解人体内各种环境中所表达蛋白质的氨基酸序列、结构以及丰度,以及 这些蛋白质之间的相互作用。研究和处理蛋白质的一个关键方面是检测。可采用多种技术, 体内或体外检测蛋白质,用于分析或制备蛋白质样品的目的。这些技术中的许多涉及使蛋 白质与可检测的结合伴侣接触。
[0004] 电泳凝胶中蛋白质的检测通常采用有色的或荧光蛋白质染料(例如考马斯亮蓝 或SYPRO Ruby)来进行。这些染料能够以很大程度上不受限于氨基酸序列的方式非共价地 结合至蛋白质,并且可在采用特定波长的光照射之时被观察到。蛋白质染料允许强力且灵 敏的检测,但会妨碍供于下游应用的生物样品的快速处理。在检测之前向凝胶施加染料的 过程(染色)可能会耗费数小时。在检测之后移去染料(脱色)也同样耗时,当制备性地使 用凝胶时,该过程是获得纯化蛋白质所必需的。染色和脱色涉及凝胶的搅动(agitation), 凝胶在水性缓冲液中长时间的浸没,以及对该缓冲液的频繁更换。在这些过程中,一些蛋白 质(尤其是低分子量且亲水性的蛋白质)会从凝胶扩散出去,并进入缓冲液,由此丢失而无 法被后续分析。因此,蛋白质染料的采用,以及伴随的凝胶处理,可能会减少在电泳之后可 被鉴定的蛋白质的数量。
[0005] 或者,可通过使蛋白质接触卤素取代的有机化合物,并使所述蛋白质暴露至紫外 光,来使该蛋白质变得可检测。如Edwards等在美国专利号US 7, 569, 103B2 (2009年8 月4日)和US 8, 007, 646 B2 (2011年8月30日)以及他处所公开的那样,该过程会导 致色氨酸的吲哚部分和卤素取代的有机化合物之间的紫外光诱导的反应。反应的色氨 酸残基被共价修饰并发荧光,其在用于诱导反应的相同波长下激发并在可见光范围内发 光。所述反应,以及用于进行所述反应并检测其产物的相关试剂、装置和方法,有时以名称 'Stain-Free?'(生物辐射实验室股份有限公司)表示。
[0006] 可在凝胶电泳之前或之后使蛋白质与卤素取代的有机化合物接触并反应。如果所 述卤素取代的有机化合物是凝胶的组成部分,则接触可在电泳过程中原位进行。相较于采 用蛋白质染料,采用共价修饰的色氨酸荧光进行蛋白质检测通常更为方便和经济,并且不 限于涉及电泳凝胶的应用。例如,可使蛋白质与卤素取代的有机化合物接触,反应,并在其 悬浮于溶液中或沉积在印迹膜上时进行检测。
[0007] 通过非共价地结合环糊精,色氨酸和其它芳族氨基酸侧链可被保护不受共价修 饰,这由 Del Valle (E.M.M. Del Valle,Process Biochemistry 39,1033-1046, 2004)和 Serno 等(T. Serno 等,Advanced Drug Delivery Reviews 63,1086_1106,2011)综述性描 述。环糊精是包含由α-(1,4)键接合的若干个(通常是6、7或8个)吡喃葡萄糖单位的 环状寡糖。在环糊精分子中,所述吡喃葡萄糖单位形成锥环形结构,其中央具有疏水腔。在 与环糊精接触,芳族氨基酸侧链可插入该腔,由此变得与其它化学相互作用隔离。环糊精已 被用作,例如,基于蛋白质的药物的赋形剂,并且可通过限制涉及芳族氨基酸的蛋白质-蛋 白质相互作用来防止蛋白质聚集。
[0008] 除了标准α_、β-和γ-环糊精之外,已经表征了具有取代的吡喃葡萄糖单 位的环糊精种类。在大多数情况中,取代基连接至第2、3和6位,所述取代基包括烷基、 羟烷基和羧烷基基团。共价连接至一个或多个氨基酸的环糊精也已被合成(参见例如, Djedaini-Pilard等,J. Chem. Soc. Perkin Trans. 2, 723-730,1995) 〇
[0009] 环糊精是能非共价地结合较小分子以形成超分子复合物的一类环状有机分子。所 述环状分子在主体-客体(host-guest)化学中作为"主体"(参见例如,H. -J. Schneider 和 A. Κ· Yatsimirsky 刊于 Chem. Soc. Rev.,37, 263-277, 2008 的综述),并且包含中央腔,以 通过氢键连接、离子键、范德华相互作用和/或疏水相互作用来容纳一个或多个具有合适 尺寸的"客体"分子。所述环状分子可以是重复单位的寡聚物或聚合物,并且可被称为大环。 环状有机主体分子的其它示例包括萌芦脲(cucurbituril),其由通过亚甲桥连接的甘脲单 体组成。已显示萌芦[8]脲以1:1的化学计量学关系结合甲基紫精,并且同时在其腔中容纳 甲基紫精和氨基酸。此外,萌芦[8]脲显示对芳族氨基酸色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的结合 特异性(参见 P. Rajgariah 和 A. R. Urbach,J. Incl. Phenom. Macrocycl. Chem. 62, 251_254, 2008)。而其它环状有机主体分子还包括柱芳烃、杯芳烃和冠醚。

【发明内容】

[0010] 本文提供方法、组合物、电泳凝胶和试剂盒。
[0011] 提供了检测蛋白质的方法。所述方法包括:使所述蛋白质与环糊精接触,所述环糊 精共价连接至至少一种标记物;使所述蛋白质与试剂接触;引起所述试剂与所述至少一种 标记物之间的化学相互作用以形成产物;和检测所述产物,由此检测所述蛋白质。
[0012] 在所述方法的一个实施方式中,所述环糊精是α-环糊精、环糊精、甲 基-β-环糊精或γ-环糊精。在另一个实施方式中,所述至少一种标记物共价连接至一个 或多个吡喃葡萄糖单位的一个或多个6位处。而在另一个实施方式中,每个环糊精的标记 物的平均数量是至少1、2、3、4、5、6、7、8、12、14、16、18、21或24个。
[0013] 在所述方法的一些实施方式中,所述至少一种标记物包含吲哚部分。在这些实施 方式的一些中,所述至少一种标记物包含色氨酸残基或多肽。在所述标记物包含吲哚部分 的其它实施方式中,所述至少一种标记物不包含色氨酸残基。
[0014] 在所述方法的一些实施方式中,所述试剂是卤素取代的有机化合物。在一个此类 实施方式中,所述卤素取代的有机化合物是氯仿、三氯乙醇、三氯乙酸酯或3-溴-1-丙醇。
[0015] 在一些实施方式中,所述方法的引起步骤涉及使所述蛋白质暴露至紫外光,并且 所述产物包含取代的吲哚部分。在一个此类实施方式中,所述取代的吲哚部分与未取代的 吲哚部分的分子量相差28、44或58Da。在另一个此类实施方式中,所述取代的吲哚部分包 含甲酰基、羧酸、羟基乙酮,或丙醇基团。
[0016] 在所述方法的一些实施方式中,检测所述产物包括检测发射光。
[0017] 在所述方法的一些实施方式中,所述至少一种标记物包含生物素部分。在一些实 施方式中,所述试剂包含如下蛋白质中的一种:亲和素、链霉亲和素和中性亲和素。在一些 实施方式中,所述化学相互作用是结合相互作用,并且所述产物是生物素和所述试剂的非 共价分子复合物。
[0018] 在一些实施方式中,所述方法还包括如下步骤:对所述蛋白质进行凝胶电泳,并且 在电泳凝胶中检测所述蛋白质。在这些实施方式的一些中,在凝胶电泳之前,使所述蛋白质 与环糊精和所述试剂接触。在一个此类实施方式中,所述环糊精和试剂悬浮于缓冲液中,并 且所述接触步骤包括使所述蛋白质与该缓冲液接触。在其它实施方式中,在凝胶电泳之后, 使所述蛋白质与环糊精和所述试剂接触。在这些其它实施方式中的一种中,所述环糊精和 试剂悬浮于缓冲液中,并且使电泳凝胶与所述缓冲液接触,由此允许环糊精和试剂扩散进 入所述电泳凝胶,并使所述蛋白质与所述环糊精和试剂接触。在其它实施方式中,所述环糊 精或试剂是所述电泳凝胶的组成部分,并且在对所述蛋白质进行凝胶电泳时使所述蛋白质 与所述环糊精或所述试剂接触。
[0019] 在对所述蛋白质进行凝胶电泳之后,所述方法可包括:将所述蛋白质转移出所述 电泳凝胶并转移至印迹膜上,并检测所述印迹膜上的蛋白质。该方法的一个实施方式还包 括从所述蛋白质移除所述环糊精、试剂,或产物。在所述方法的其它实施方式中,所述蛋白 质包含亲和标签或抗体结合表位,并且,检测所述印迹膜上的蛋白质包括使所述印迹膜与 所述亲和标签或抗体结合表位的结合伴侣接触。所述亲和标签或抗体结合表位可包含色氨 酸残基,并且在一个此类实施方式中,所述亲和标签是Str印-标签。
[0020] 本文还提供一种组合物,其包含:共价连接至至少一种标记物的环糊精;和试剂, 所述试剂能够与所述至少一种标记物发生化学相互作用,由此使所述标记物可检测。
[0021] 在所述组合物的一个实施方式中,所述环糊精是α-环糊精、环糊精、甲 基-β-环糊精或γ-环糊精。在另一个实施方式中,所述至少一种标记物共价连接至一个 或多个吡喃葡萄糖单位的一个或多个6位处。
[0022] 在所述组合物一些实施方式中,所述至少一种标记物包含吲哚部分。在这些实施 方式的一些中,所述至少一种标记物包含色氨酸残基或多肽。在所述至少一种标记物包含 吲哚部分的其它实施方式中,所述至少一种标记物不包含色氨酸残基。
[0023] 在一些实施方式中,组合物中的所述试剂是卤素取代的有机化合物。在一个此类 实施方式中,所述卤素取代的有机化合物是氯仿、三氯乙醇、三氯乙酸酯或3-溴-1-丙醇。
[0024] 在所述组合物的一些实施方式中,所述至少一种标记物包含生物素部分。在一些 实施方式中,所述试剂包含如下蛋白质中的一种:亲和素、链霉亲和素和中性亲和素。
[0025] 在所述组合物的其它实施方式中,每个环糊精的标记物的平均数量是至少1、2、3、 4、5、6、7、8、12、14、16、18、21 或 24 个。
[0026] 本文还提供电泳凝胶。在一些实施方式中,所述电泳凝胶包含上述组合物。
[0027] 在其它实施方式中,所述电泳凝胶包含环糊精,所述环糊精共价连接至至少一种 标记物。在一个此类实施方式中,所述环糊精是α-环糊精、β-环糊精、甲基-β-环糊精 或γ-环糊精。在另一个此类实施方式中,所述至少一种标记物共价连接至一个或多个P比 喃葡萄糖单位的一个或多个6位处。
[0028] 在所述电泳凝胶的一些实施方式中,所述至少一种标记物包含吲哚部分。在这些 实施方式的一些中,所述至少一种标记物
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