生产o-乙酰基高丝氨酸的微生物和用其生产o-乙酰基高丝氨酸的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生产0-乙酰基高丝氨酸的埃希氏菌属（Escherichia sp.)微生物，和 用该微生物高产率生产〇-乙酰基高丝氨酸的方法。
【背景技术】
[0002] 0-乙酰基高丝氨酸是甲硫氨酸的前体，而甲硫氨酸是身体必需氨基酸之一。甲硫 氨酸作为医用输注液的组分和医疗产品原料以及动物饲料和食物添加剂已被广泛使用。
[0003] 甲硫氨酸可生物学或化学合成。近来，公开了两步法，其中将通过发酵生产的 L-甲硫氨酸前体通过酶反应转化成L-甲硫氨酸（国际公开号WO 2008/013432)。在上述 两步法中，〇-琥珀酰基高丝氨酸和〇-乙酰基高丝氨酸可用作甲硫氨酸前体，并且高产率生 产0-乙酰基高丝氨酸以大规模成本有效地生产甲硫氨酸非常重要。
【发明内容】
[0004] 技术问题
[0005] 发明人在试图提高0-乙酰基高丝氨酸生产时发现柠檬酸合酶蛋白的表达或活性 减少可显著增加0-乙酰基高丝氨酸的生产能力，从而完成本发明。
[0006] 技术方案
[0007] 本发明的一个目的是提供0-乙酰基高丝氨酸生产能力提高的0-乙酰基高丝氨酸 生产微生物。
[0008] 本发明的另一目的是提供利用该微生物生产0-乙酰基高丝氨酸的方法。
[0009] 有利效果
[0010] 使用根据本发明所述的具有0-乙酰基高丝氨酸生产能力的微生物可比化学合成 以更高产率和更加环境友好的方式生产〇-乙酰基高丝氨酸。另外，由此生产的〇-乙酰基 高丝氨酸可通过0-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶，用作甲硫氨酸和乙酸合成的前体，从而实 现L-甲硫氨酸的生物转化，并且由此转化的L-甲硫氨酸可广泛用于生产人类食物或食物 添加剂以及动物饲料或动物饲料添加剂。
[0011] 附图简述
[0012] 图1是用于构建柠檬酸合酶活性减弱的微生物的表达盒设计。
[0013] 图2是pBAD24-柠檬酸合酶反义RNA(asRNA)载体的限制图谱。
[0014] 最佳方式
[0015] -方面，本发明提供生产0-乙酰基高丝氨酸的埃希氏菌属微生物，其中内源柠檬 酸合酶蛋白的活性被减弱或灭活。
[0016] 如本文所用，术语"0-乙酰基高丝氨酸" 一一其是微生物的甲硫氨酸生物合成途 径中的具体中间材料--意指L-高丝氨酸的乙酰基衍生物。0-乙酰基高丝氨酸可利用高 丝氨酸和乙酰辅酶A作为底物、通过使乙酰基从乙酰辅酶A转移至高丝氨酸的酶活性来生 产。
[0017] 如本文所用，术语"生产0-乙酰基高丝氨酸的微生物"包括这样的微生物：在活体 生物内生产〇-乙酰基高丝氨酸的真核或原核微生物，具有〇-乙酰基高丝氨酸生产能力，而 其亲本微生物不具有0-乙酰基高丝氨酸生产能力；或这样的微生物：内源地具有0-乙酰 基尚丝氣酸生广能力。
[0018] 可通过物种的改良来提供或促进O-乙酰基高丝氨酸生产能力。具有O-乙酰基 高丝氨酸生产能力的微生物可包括属于埃希氏菌属、欧文氏菌属（Erwinia sp.)、沙雷氏菌 属（Serratia sp.)、普罗威登斯菌属（Providencia sp.)、棒状杆菌属（Corynebacteria sp.)、假单胞菌属（Pseudomonas sp.)、钩端螺旋体属（Leptospira sp.)、沙门氏菌 属（Salmonella sp.)、短杆菌属(Brevibacteria sp. )、Hypomononas sp.、色杆菌属 (Chromobacterium sp·)、和诺卡氏菌属（Norcardia sp·)、或真菌、或酵母的微生物；具体 地，属于埃希氏菌属、棒状杆菌属、钩端螺旋体属、和酵母的微生物；和更具体地，属于埃希 氏菌属的微生物，具体例如，大肠杆菌（Escherichia Coli)。具有0-乙酰基高丝氨酸生产 能力的微生物可以是生产下列的微生物：L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸、或L-甲硫氨 酸或其衍生物，但不限于此。
[0019] 如本文所用，术语"柠檬酸合酶（E. C. 2. 3. 3. 1) "意指介导草酰乙酸盐 (oxaloacetate)和乙酰辅酶A之间的反应的TCA循环第一步中的酶。具体地，梓檬酸合酶 介导乙酰辅酶A中具有两个碳原子的乙酸残基和具有四个碳原子的草酰乙酸盐之间的缩 合反应，从而生成具有六个碳原子的柠檬酸盐（citrate)。在大肠杆菌中，柠檬酸合酶被命 名为GltA，柠檬酸合酶和GltA在本发明中可互换使用。
[0020] 乙酰辅酶A+草酰乙酸盐+H2O -柠檬酸盐+辅酶A-SH
[0021 ] 具体地，柠檬酸合酶可以是源自埃希氏菌属的柠檬酸合酶，更具体地源自大肠杆 菌的GltA。柠檬酸合酶可以是这样的蛋白质：包括SEQ ID NO :4表示的氨基酸序列；或与 SEQ ID NO :4的氨基酸序列具有70%或更高，具体地80%或更高、或更具体地90%或更高 的同源性的氨基酸序列。另外，作为具有同源性的序列，如果该氨基酸序列是具有与SEQ ID NO :4相同或相应柠檬酸合酶活性的氨基酸序列，则在部分序列中具有敲除、修饰、替换、或 添加的氨基酸序列显然也应被包括在本发明的范围内。另外，基于遗传密码简并，编码相同 氨基酸序列和其变体的多核苷酸序列也应被包括本发明的范围内。
[0022] 如本文所用，术语"内源"活性意指蛋白质在微生物中的天然状态或微生物中提供 的相应蛋白质在修饰前的活性状态。
[0023] "蛋白质活性与其内源活性相比减弱或灭活（失活，inactivation) "意指蛋白质 活性在与其天然状态具有的活性相比时降低或消除。减弱是表示如下情况的概念：由于蛋 白质编码基因的修饰，蛋白质活性与微生物原本具有的蛋白质活性相比降低；整体蛋白质 表达水平低于微生物自然型菌株的整体蛋白质表达水平；或其组合，但不限于此。灭活包括 如下情况：编码蛋白质的基因与自然型菌株相比完全不被表达；和基因被表达，但不呈现 活性。
[0024] 蛋白质活性的减弱或灭活可通过本领域公知的各种方法实现。方法实例可包括用 修饰基因替换染色体上编码蛋白质的基因从而可降低酶活性（其包括去除蛋白质活性的 情况）的方法；在染色体上编码蛋白质的基因的表达调控序列上引入修饰的方法；用具有 弱活性或不具有活性的序列替换编码蛋白质的基因的表达调控序列的方法；敲除染色体上 编码蛋白质的基因的部分或整体的方法；引入反义寡核苷酸（例如，反义RNA)的方法，该 反义寡核苷酸通过互补结合至染色体上的基因的转录物而抑制从mRNA至蛋白质的翻译； 致使核糖体附着不能进行的方法一一通过在编码蛋白质的基因的SD序列前端人为添加 Shine-Dalgarno (SD)序列和其互补序列而形成二级结构；逆转录工程（RTE)方法--添加 启动子以在相应序列的开放阅读框（ORF)的3'端逆转录；等，并且也包括其组合，但不限于 此。
[0025] 具体地，敲除编码蛋白质的基因的部分或整体的方法可通过如下进行：经由将染 色体插入微生物的载体，用多核苷酸或（在多核苷酸序列部分被敲除时）标记物替换染色 体中编码内源目标蛋白质的多核苷酸。例如，可采用通过同源重组进行基因敲除的方法，但 不限于此。另外，如本文所用，术语"部分"，虽然可依据多核苷酸种类而变，但可具体意指1 个核苷酸至300个核苷酸，更具体地1个核苷酸至100个核苷酸，还更具体地1个核苷酸至 50个核苷酸，但不限于此。
[0026] 另外，修饰表达调控序列的方法可通过如下进行：诱导多核苷酸序列的表达调控 序列改变一一通过敲除、插入、保守型替换、非保守型替换或其组合，以进一步减弱表达调 控序列的活性；或用活性较弱的多核苷酸序列替换多核苷酸序列。多核苷酸序列可包括启 动子、操纵子序列、编码核糖体结合域的序列、和调控转录和翻译终止的序列，但不限于此。
[0027] 另外，修饰染色体上的基因序列的方法可通过如下进行：诱导该序列改变--通 过敲除、插入、保守型替换、非保守型替换、或其组合，以进一步减弱表达调控序列的活性； 或用具有较弱活性的改良基因序列或不具有活性的改良基因序列替换该序列，但不限于 此。
[0028] 具体地，关于柠檬酸合酶蛋白活性减弱，可用其他氨基酸（一个或多个）取代柠檬 酸合酶蛋白的氨基酸序列中部分氨基酸（一个或多个）。更具体地，可包括具有如下氨基酸 序列的柠檬酸合酶：柠檬酸合酶蛋白的氨基酸序列中的第145位氨基酸或第167位氨基酸 由酪氨酸（Y)或赖氨酸（K)被取代成其他氨基酸（一个或多个）。还更具体地，柠檬酸合酶 可以是具有编码如下修饰多肽的基因序列的柠檬酸合酶：其中柠檬酸合酶蛋白的氨基酸序 列中第145位氨基酸由酪氨酸（Y)被取代成丙氨酸（A)，并且第167位氨基酸由赖氨酸（K) 被取代成丙氨酸（A)取代。具体地，在将起始密码子编码的甲硫氨酸的下一位氨基酸设置 为第1位氨基酸后，按序列顺序确定氨基酸残基数量。多肽可分别具有SEQ ID NO :1或2 表示的氨基酸序列。另外，如果柠檬酸合酶的活性弱于野生型的活性，则柠檬酸合酶可包括 与SEQ ID NO :1或2的氨基酸序列具有80%或更高，具体地90%或更高，更具体地95%或 更高，还更具体地97%或更高同源性的氨基酸序列。作为具有同源性的序列，如果该氨基酸 序列是与SEQ ID NO :1或2的蛋白质具有基本上相同或相应的生物学活性的氨基酸序列， 则在部分序列具有敲除、修饰、替换、或添加的氨基酸序列显然也应被包括在本发明的范围 内。
[0029] 如本文所用，术语"同源性"意指两个多核苷酸或多肽部分之间的同一性百分 比。一部分与另一部分的序列之间的同源性可通过本领域已知的技术确定。例如，同源 性可通过如下确定：利用计算机程序排列，在两个不同多核苷酸分子或两个不同多肽之间 直接排列序列信息和容易地获得序列信息。计算机程序可包括BLAST(NCBI)、CLC Main Workbench(CLC bio)、MegAlignTM(DNASTAR Inc)等。另外，多核苷酸之间的同源性可通过 如下确定：在同源区之间形成稳定双链的条件下杂交多核苷酸，利用单链特异性核酸酶进 行分解，和确定分解片段。
[0030] 如本文所用，术语"同源性"意指具有"共同进化起源"的蛋白质之间的关系，包括 源自超家族蛋白质的所有语法形式或拼写变型的同源蛋白质，和源自不同物种的同源蛋白 质。这些蛋白质（及其编码基因）具有通过高水平序列相似性反映的序列同源性。然而， 普遍使用和本发明使用的术语"同源性"意指被诸如"非常高"的形容词修饰的序列相似性， 而非意指共同的进化起源。
[0031] 在本发明的示例性实施方式中，微生物可以是胱硫醚γ合酶（EC 2. 5. 1. 48)、高 丝氨酸激酶（EC 2. 7. 1. 39)、或二者的活性弱于其内源活性或灭活的微生物。
[0032] 如本文所用，术语"胱硫醚γ合酶"意指可利用0-琥珀酰基高丝氨酸和L-半胱 氨酸作为底物通过下述化学反应合成胱硫醚的酶。在本发明中，来自大肠杆菌（E. coli)的 胱硫醚γ合酶被命名为"MetB"。
[0033] 0-琥泊酰基-L-高丝氨酸+L-半胱氨酸一L-胱硫醚+琥?自酸盐（succinate)
[0034] 具体地，来自大肠杆菌的胱硫醚γ合酶一一虽然并非具体限于此一一可以是包括 SEQ ID NO :9表示的氨基酸序列或与SEQ ID NO :9的氨基酸序列具有70 %或更高，具体地 80%或更高，更具体地90%或更高同源性的氨基酸序列的蛋白质。另外，作为具有同源性的 序列，如果该氨基酸序列是与SEQ ID NO :9的氨基酸序列具有相同或相应高丝氨酸激酶活 性的氨基酸序列，则在部分序列具有敲除、修饰、替换、或添加的氨基酸序列显然也应被包 括在本发明的范围内。另外，基于遗传密码简并，编码相同氨基酸序列和其变体的多核苷酸 序列也应被包括在本发明的范围