一种二羟基异喹啉及其从蜈蚣中制备的方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及药物领域，具体涉及从蜈蚣中提取一种新化合物3, 8-二羟基异喹啉 以及该活性物质在抗疟疾活性、抗菌活性和抗肿瘤活性药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 恶性肿瘤是人类健康的首要杀手。传统肿瘤治疗虽然具有一定疗效，但由于化学 药物非特异的细胞毒性，对患者具有较大的毒副作用，同时还容易产生耐药性，给肿瘤患者 带来巨大痛苦。从1972年Folkman提出了肿瘤血管增生学说以来，通过抑制肿瘤血管增生 来治疗肿瘤的报道大量涌现，并取得了巨大成功。肿瘤血管生成是肿瘤生长和转移的形态 学基础。绝大多数恶性实体肿瘤如卵巢癌、肝癌、宫颈癌和乳腺癌等都是血管依赖性肿瘤。 新生血管一方面为肿瘤生长提供营养和氧气，另一方面还是肿瘤转移的重要途径。因此，抑 制肿瘤新生血管可以有效抑制肿瘤的发生、发展及转移。
[0003] 蜈蚣为陆生节肢动物，全体共22个环节。头部暗红色或红褐色，略有光泽，有头板 覆盖，头板近圆形，前端稍突出，两侧贴有颚肢一对，前端两侧有触角一对。躯干部第一背 板与头板同色，其余20个背板为棕绿色或墨绿色，具光泽，自第四背板至第二十背板上常 有两条纵沟线；腹部淡黄色或棕黄色，皱缩；自第二节起，每节两侧有步足一对；步足黄色 或红褐色，偶有黄白色，呈弯钩形，最末一对步足尾状，故又称尾足，易脱落。质脆，断面有裂 隙。气微腥，有特殊刺鼻的臭气，味辛、微咸。功能主治息风镇痉，功毒散结，通络止痛。用 于小儿惊风，抽搐痉挛，中风口歪，半身不遂，破伤风，风湿顽痹，疮疡，瘰疬，毒蛇咬伤。
[0004] 蜈蚣中成分复杂，含两种类似蜂毒的有毒成分，即组胺样物质及溶血性蛋白质；尚 含脂肪油、胆留醇、蚁酸等。又曾分离出S -羟基赖氨酸；氨基酸有组氨酸、精氨酸、鸟氨酸、 赖氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、牛磺酸、谷氨酸。经文献查阅， 有研究者（曲爱兵，赵维诚，梁良等蜈蚣组织提取物抗肿瘤活性的初步研究[J].实用肿瘤 学杂志，2003,17 (1) :29-30)采用MTT法检测蜈蚣组织提取液，发现其对胃癌细胞和肝癌细 胞较强的细胞毒性。还有科研工作者（王硕，覃文慧多棘蜈蚣与少棘蜈蚣抗肿瘤作用研究 [J].中国实验方剂学杂志，2011，13 :156-158)采用相同的方法检测多棘巨蜈蚣和少棘巨 蜈蚣的匀浆液对人肝癌细胞Bel-7402的作用，确证了两种蜈蚣均有较强的抗肿瘤作用。解 放军第四五八医院（韩莉，周永芹，韩钰蜈蚣提取物诱导宫颈癌Hela细胞凋亡及其机制的 研究[J].时珍国医国药，2007，18(9) :2109-2111)以类似方法观察蜈蚣对宫颈癌Hela细 胞增殖的影响，证明蜈蚣的乙醚、乙醇提取物对Hela细胞具有显著的体外抗肿瘤活性。南 京师范大学江苏省分子医学生物技术重点实验室（任文华，张双全等少棘蜈蚣水提取物的 抗菌活性[J].中药材，2007,01 :10-14)提取了蜈蚣水提物并确定其具有一定的抗菌活性。 但是目前尚未有研究证明蜈蚣中具有抗肿瘤或抗菌活性的组分具体是哪种物质，由于蜈蚣 提取物的组分复杂，而且可能还含有类似蜂毒的有毒成分，因此蜈蚣在制备抗肿瘤或抗菌 药物领域中的应用一直受到限制。
[0005] 抗肿瘤生物碱中大多为异喹啉类生物碱，该类生物碱应用广泛，其结构具有多样 性。Rexahn 公司(Lee Young Bok, Ahn Chang-Ho, Cho Won-Jea. Substituted 3- (hetero) arylisquinolinamine derivatives for therapeutic applications. WO 2008063548 A2, 2008. 5. 29)拥有的5, 6或7取代3-氨基异喹啉衍生物可产生抗肿瘤作用，其能够显 著抑制耐紫杉醇（泰素）HCT-15人结肠癌细胞荷瘤裸鼠模型肿瘤的生长。中国专利申 请号为201210098631. 2,申请公布日为2012年7月25日的专利申请文件公开了二氢异 喹啉类化合物及其作为制备植物抗菌药物的应用，该发明中合成了一系列二氢异喹啉类 化合物作为植物抗菌药物，对多种植物病原菌具有良好的抑制作用。中国专利申请号为 201280041436. 4,申请公布日为2014年7月16日的专利申请文件公开了一种取代的2-烷 基-1-氧代-N-苯基-3-杂芳基-1，2, 3, 4-四氢异喹啉-4-酰胺，可用于预防和治疗疟疾。 虽然目前关于异喹啉类化合物用于抗菌或抗肿瘤治疗的研究很多，关于其他结构的化合物 用于抗菌或抗肿瘤治疗的研究也很多，但是蜈蚣中具体哪种组分物质具有抗肿瘤和抗菌功 能一直是领域内未知的，所以研究确定蜈蚣中的活性组分物质的具体结构具有非常重要的 医学价值。
【发明内容】
[0006] 1.要解决的问题
[0007] 针对现有技术中蜈蚣的活性组分不明确、应用受到限制等问题，本发明提供一 种二羟基异喹啉及其从蜈蚣中制备的方法和应用，本发明从蜈蚣中提取的活性组分为 3, 8-二羟基异喹啉，具有抗疟疾、抗菌和抗肿瘤的功能，首次确定了蜈蚣中活性组分的具体 结构，天然无毒性，活性效果好。
[0008] 2.技术方案
[0009] 为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
[0010] -种二羟基异喹啉，其分子式为C9H7N02，为3, 8-二羟基异喹啉，分子量为161. 1， 结构式为：
[0012] 一种从蜈蚣中提取活性组分的方法，其步骤为：
[0013] a.用体积浓度为45-65 %的醇溶液制备蜈蚣醇提物；
[0014] b.采用葡聚糖凝胶层析法分离纯化步骤a中的蜈蚣醇提物，收集多个组分样品， 检测确定其中抗肿瘤活性最好的组分样品，记为组分样品A，组分样品A中含有上述的二羟 基异喹啉。
[0015] 优选地，步骤a中制备蜈蚣醇提物的步骤为：
[0016] (1)制备蜈蚣粉末，然后加入5-10倍蜈蚣粉末体积的PBS溶液进行超声破碎匀 浆；
[0017] (2)对匀浆液冷冻离心，取上清液，冷冻干燥得到冻干的蜈蚣水提物；
[0018] (3)取步骤⑵中的得到的水提物加入蜈蚣粉末体积5-10倍的醇溶液进行匀浆， 然后在4°C条件下浸取，醇溶液的体积浓度为45-65% ;
[0019] (4)对浸取液再次冷冻离心，取上清液，冷冻干燥得到冻干的蜈蚣醇提物。
[0020] 优选地，步骤b中采用葡聚糖凝胶层析法分离纯化蜈蚣醇提物的步骤为：
[0021] (1)将葡聚糖凝胶S印hadex G25注入层析柱中，用流动相冲洗，流动相为10~ 50 %乙醇；
[0022] (2)将蜈蚁醇提物配置成20~50mg/mL，在层析柱中上样4~8mL，流速为0· 6~ 2mL/min，按照层析图谱收集各组分样品，对各组分样品进行活性检测，抗肿瘤活性最好的 组分记为组分样品A。
[0023] -种制备上述的二羟基异喹啉的方法，其步骤为：
[0024] (a)用体积浓度为45-65 %的醇溶液制备蜈蚣醇提物；
[0025] (b)采用葡聚糖凝胶层析法分离纯化步骤（a)中的蜈蚣醇提物，收集多个组分样 品，检测这些组分样品的抗肿瘤活性，抗肿瘤活性最好的组分记为组分样品A ;
[0026] (c)采用制备型RP-HPLC分离纯化步骤（b)中得到的组分样品A，进行梯度洗脱收 集多个活性峰组分，检测这些活性峰组分的抗肿瘤活性，抗肿瘤活性最好的组分记为组分 B ；
[0027] (d)采用半制备型RP-HPLC分离纯化步骤（c)中的组分B，进行梯度洗脱收集多个 活性峰组分，检测这些活性峰组分的抗肿瘤活性，抗肿瘤活性最好的组分即为上述的二羟 基异喹啉。
[0028] 3, 8-二羟基异喹啉在制备抗疟疾药物、抗菌药物及抗肿瘤药物中的应用。
[0029] 优选地，所述的疟疾为起源于寄生于人体的间日疟原虫、三日疟原虫、恶性疟原虫 和卵形疟原虫。
[0030] 优选地，所述的菌包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、甲/乙型溶血 性链球菌、肺炎链球菌和嗜血流感杆菌。
[0031] 优选地，所述的肿瘤为起源于人的头颈部、脑、甲状腺、胰腺、肺脏、肝脏、食管、胃、 乳腺、肾脏、胆囊、结肠或直肠、卵巢、子宫、子宫颈、前列腺、膀胱、睾丸的原发或继发的癌以 及肉瘤。
[0032] 3.有益效果
[0033] 相比于现有技术，本发明的有益效果为：
[0034] (1)本发明经过大量的实验摸索，首次从蜈蚣中发现了新化合物3, 8-二羟基异喹 啉以及其在抗疟疾、抗菌和抗肿瘤药物中的应用，实验结果表明，3, 8-二羟基异喹啉可用于 治疗症疾，还具有杀菌的功能，同时还能治疗实体肿瘤；所述的症疾为寄生于人体的间曰症 原虫，三日疟原虫，恶性疟原虫和卵形疟原虫；所述的菌为大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，铜绿 假单胞菌，甲/乙型溶血性链球菌，肺炎链球菌和嗜血流感杆菌；所述的肿瘤为起源于人的 头颈部、脑、甲状腺、胰腺、肺脏、肝脏、食管、胃、乳腺、肾脏、胆囊、结肠或直肠、卵巢、子宫、 子宫颈、前列腺、膀胱、睾丸的原发或继发的癌以及肉瘤；
[0035] (2)本发明通过不同的方法对蜈蚣粉末进行提取，采用MTT法对蜈蚣粉末的多种 提取液进行活性检测，找到了抗肿瘤活性最佳的提取物，然后采用葡聚糖凝胶层析和制备 型高效液相等多种手段对该提取物分离纯化，通过高效液相、质谱、氢谱、碳谱和红外等手 段对分离的化合物进行分析，首次确定了蜈蚣醇提物活性组分中起到抗疟疾、抗菌和抗肿 瘤活性的主要成分为3, 8-二羟基异喹啉；
[0036] (3)本发明通过大量实验测试，得出乙醇浸取能从蜈蚣粉末中提取出最佳抗肿瘤 活性组分，去除或减少与抗肿瘤无关的组分，提取后的组分具有更