一种岩藻聚糖硫酸酯、其制备方法和用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及提取多糖，更具体地说，涉及一种岩藻聚糖硫酸酯、其制备方法及在制 备用于预防或治疗肿瘤的药物或保健品中的应用。
【背景技术】
[0002] 肿瘤是威胁全世界人民健康的头号杀手。每年因肿瘤死亡的人数位居所有疾病之 首。随着环境的恶化以及人民生活压力的增加，肿瘤的发病率有逐年升高的趋势。治疗肿 瘤的策略有很多。抑制血管生成就是治疗肿瘤的一种有效的策略。自从1971年Folkman 提出通过抑制新生血管生成来治疗肿瘤的思路后，人们对于肿瘤治疗的思路得到了极大的 拓宽。目前已有一些小分子和生物大分子成为通过抗血管生成来治疗肿瘤的药物。
[0003] BMP (bone morphogenetic protein，骨形成蛋白）是一类属于 TGF-β (转化生长 因子β)超家族的细胞因子。最初研究人员发现BMP能促进骨的形成，所以把这一类氨基 酸序列同源性高、结构相似的生长因子称为骨形成蛋白。但是后续深入的研究表明，这一类 蛋白不仅仅是与骨形成有关，它还与各种细胞的分化、器官形成有密切关系。通过抑制BMP4 的信号通路，可以抑制新生血管生成，实现抗肿瘤的目的。
[0004] 多糖物质是海蕴藻体的重要组成部分，目前研究较少。现有的研究仅限于海蕴岩 藻聚糖硫酸酯结构的初步表征，并不了解其详细结构，并且没有关于海蕴来源的岩藻聚糖 硫酸酯的生物活性的报道。
【发明内容】
[0005] 本申请的发明人经过广泛深入的研究，利用一种简单有效的多糖提取工艺和方 法，从海蕴（Nemacystus decipiens)提取获得了一种岩藻聚糖硫酸酯。药理实验表明，所 述岩藻聚糖硫酸酯可以剂量依赖性地抑制HMEC-I细胞的迀移和管腔形成，其作用机制是 与BMP4结合并抑制下游信号通路，同时下调BMP4的表达水平，具有潜在的预防或治疗肿瘤 的作用。
[0006] 因此，本发明的一个方面是提供一种岩藻聚糖硫酸酯，其结构式如下：
[0008] 其中，a 为约 17. 6mol %，b 为约 45. Omol %，c 为约 16. 6mol %，d 为约 20. 8mol %，
[0009] R为结构式如下的基团：
[0011] 其中，m为4, η为5, O为3, P为4, q为7, r为4,并且乙酰基的位置可以是 a _L_1，3_Fucp4S 的 C2 位或 a _L_1，3-Fucp 的 C2 位，
[0012] 其中，Fuc代表岩藻糖，GlcA代表葡萄糖醛酸，Man代表甘露糖。
[0013] 图6显示了根据本发明的岩藻聚糖硫酸酯的结构式的放大图。
[0014] 上式和图6中，α和β代表糖苷键连接的两种构型，D和L代表单糖的构型，p代 表糖环是吡喃型，箭头代表一个化学键，箭头两边的数字代表糖苷键的成键位置。括号外面 字母代表的数字是相应基团的摩尔比。
[0015] 其中，所述岩藻聚糖硫酸酯的重均分子量范围为约10_350kD，优选为约 100-280kD，更优选为约 150-250kD。
[0016] 所述岩藻聚糖硫酸酯含有甘露糖、葡萄糖醛酸、岩藻糖、硫酸基和乙酰基，它们的 摩尔比为约 3. 0:14. 4:82. 6:34. 3:13. 9。
[0017] 所述岩藻聚糖硫酸酯具有基本上与图1中的主要伸缩振动吸收峰一致的红外 图谱，其中，在所述岩藻聚糖硫酸酯的红外图谱中，3447. Icm1附近为O-H伸缩振动吸收 峰，2928. 4cm 1附近为C-H伸缩振动吸收峰，1000 -HOOcm 1附近为C-O和糖环振动信号， 1256. 4cm 1附近是0 = S = 0伸缩振动吸收峰。
[0018] 所述岩藻聚糖硫酸酯具有基本上与图2中的主要信号值一致的13C-NMR谱，其中， 在所述岩藻聚糖硫酸酯的 13C-NMR谱中，位于δ 175. 75的信号是葡糖糖醛酸的羧基碳信号， 位于δ 174. 51的信号是岩藻糖上乙酰基的羰基碳信号，位于δ 91- δ 103的端基碳信号分 别为末端岩藻糖、1，4-岩藻糖、1，3-岩藻糖、1，3, 4-岩藻糖、1，2-甘露糖、1，2, 3-甘露糖、 1，2, 4-甘露糖、1，2, 6-甘露糖和末端甘露糖的Cl信号；在δ 16. 29左右为岩藻糖甲基碳的 信号峰；在S 21. 29处为乙酰基甲基碳的信号峰。
[0019] 所述岩藻聚糖硫酸酯具有基本上与图3中的主要信号值一致的1H-NMR谱。其 中，在所述岩藻聚糖硫酸酯的 1H-NMR谱中，位于δ 5. 0-5. 7的信号是异头氢的信号，位于 δ 3. 25-4. 65的信号是糖环上的氢的信号，位于δ 2. 28附近的信号是典型的乙酰基上甲基 氢的信号，位于δ 1. 30附近的信号是岩藻糖Η6的信号。根据δ 2. 28附近的信号和δ 1. 30 附近的信号的积分面积比可知，乙酰基与岩藻糖的摩尔比为0. 168:1。由于岩藻糖占总糖的 摩尔分数是82.6%。所以可以换算出乙酰基与总糖的摩尔比是0.139:1。从上述结果可以 发现本发明的岩藻聚糖硫酸酯是一种乙酰化的岩藻聚糖硫酸酯。
[0020] 优选地，本发明的岩藻聚糖硫酸酯是从海蕴（Nemacystus decipiens)中提取出的 多糖。
[0021] 本发明的另一方面是提供所述岩藻聚糖硫酸酯的制备方法，该方法包括以下步 骤：
[0022] a.多糖提取：干燥的海蕴经乙醇脱脂后用约20°C -90°C (优选约50°C -80°C，更 优选约80°C )水提取，提取液过滤后浓缩得到浓缩液，向浓缩液中加入乙醇至乙醇浓度为 约40% -90% (V/V)(优选约80% (V/V))得到沉淀，将沉淀干燥后得水提粗多糖；
[0023] b.多糖纯化：将步骤a得到的水提粗多糖用强阴离子柱（例如，Q sepharose Fast Flow)进行分级纯化，依次用水和约0. 1-0. 5M NaCl (优选约0. 1-0. 4M，更优选约 0. 15-0. 3M，最优选约0. 2M NaCl)水溶液洗脱，收集NaCl水溶液洗脱组分得纯化多糖，纯化 多糖再经凝胶色谱（例如，Sephacryl S-300HR)纯化得到根据本发明的岩藻聚糖硫酸酯。
[0024] 更具体地，本发明提供的岩藻聚糖硫酸酯的制备方法包括以下步骤：
[0025] a.多糖提取：干燥的褐藻海蕴经乙醇脱脂，风干，用约20 °C -90 °C (优选约 50°C -80°C，更优选约80°C )去离子水提取，过滤，残渣再次用所述去离子水提取，如此反复 提取4-20次，滤液合并，加热浓缩，透析，再浓缩，加入乙醇至乙醇浓度为约40% -90% (V/ V)(优选约80% (V/V))，离心得沉淀，沉淀经无水乙醇和无水丙酮依次洗涤后，真空干燥得 水提粗多糖；
[0026] b.多糖纯化：将步骤a中得到的水提海蕴粗多糖用强阴离子柱（例如，Q sepharose Fast Flow)进行分级纯化，依次用水和约0. 1-0. 5M NaCl (优选约0. 1-0. 4M，更 优选约0. 15-0. 3M，最优选约0. 2M NaCl)水溶液洗脱，收集NaCl水溶液洗脱组分得纯化多 糖，纯化多糖再经凝胶色谱（例如，Sephacryl S-300HR)纯化得到根据本发明的岩藻聚糖 硫酸酯。
[0027] 根据本发明的岩藻聚糖硫酸酯能与BMP4强烈结合，显著地抑制BMP4的表达，并且 通过显著地抑制Smadl/5/8的磷酸化而阻断BMP4/Smad信号通路，从而抑制BMP4诱导的管 腔形成，由此能够抑制表皮血管内皮细胞的生长和迀移，具有抗血管生成活性，进而能够用 于预防或治疗肿瘤。
[0028] 因此，本发明的又一方面是提供上述根据本发明的岩藻聚糖硫酸酯在制备用于抑 制BMP4的表达的药物组合物或保健品中的用途。
[0029] 本发明的又一方面是提供上述根据本发明的岩藻聚糖硫酸酯在制备用于抑制 Smadl/5/8的磷酸化的药物组合物或保健品中的用途。
[0030] 本发明的又一方面是提供上述根据本发明的岩藻聚糖硫酸酯在制备用于阻断 BMP4/Smad信号通路的药物组合物或保健品中的用途。
[0031] 本发明的又一方面是提供上述根据本发明的岩藻聚糖硫酸酯在制备用于抑制 BMP4诱导的管腔形成的药物组合物或保健品中的用途。
[0032] 本发明的又一方面是提供上述根据本发明的岩藻聚糖硫酸酯在制备用于抑制表 皮血管内皮细胞的生长和迀移的药物组合物或保健品中的用途。
[0033] 本发明的又一方面是提供上述根据本发明的岩藻聚糖硫酸酯在制备用于抗血管 生成的药物组合物或保健品中的用途。
[0034] 本发明的又一方面是提供上述根据本发明的岩藻聚糖硫酸酯在制备预防或治疗 肿瘤的药物组合物或保健品中的用途。
[0035] 本发明的再一方面是提供一种药物组合物，其包含上述根据本发明的岩藻聚