杂交瘤细胞株imi-g12及其产生的新烟碱类农药通用单克隆抗体和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于小分子化合物的免疫分析快速检测领域，具体涉及一种杂交瘤细胞株 HO-G12及其产生的抗6种新烟碱类农药的通用单克隆抗体，可用于吡虫啉、氯噻啉、噻虫 胺、噻虫啉、啶虫脒和烯啶虫胺这6种氯代烟碱类农药的多残留快速筛查。
【背景技术】
[0002] 新烟碱类农药是在烟碱结构研究的基础上，于20世纪80年代起开发、筛选和合成 出来的一类新型杀虫剂。它作为激动剂，能选择性作用于昆虫烟碱型乙酰胆碱受体，阻断昆 虫中枢神经系统的正常传导，从而致使害虫出现麻痹进而死亡。其不仅具有高效、广谱及良 好的根部内吸性、触杀和胃毒作用，而且对哺乳动物毒性较低，对环境相容性较好。此外，由 于这类杀虫剂的作用靶标和方式与以往的有机磷、氨基甲酸酯和拟除虫菊酯类等杀虫剂不 同，它们之间不存在靶标交互抗性。因此，新烟碱类农药在杀虫剂市场所占的比例日趋增 长，目前已商品化的有吡虫啉、啶虫脒、噻虫啉、烯啶虫胺、噻虫嗪、噻虫胺、呋虫胺和由我国 自主研发的氯噻啉共8个品种（图1)。然而，近年来有研究报道了新烟碱类农药对传粉昆 虫、鸟类生殖系统和老鼠呼吸系统等方面的负面影响，特别是欧美等国调查发现该类农药 对蜜蜂存在巨大的潜在危害。欧盟已于2013年发布报告并建议新烟碱类农药禁止用于由 蜜蜂进行授粉的作物。所以，建立新烟碱类农药多残留的快速分析方法尤为重要。
[0003] 常规的新烟碱类农药残留检测方法有气相、液相色谱及质谱联用等仪器分析法， 其灵敏度高、准确性好，但设备条件要求高、前处理复杂，难以满足大批量样品现场快速检 测的需求。近些年发展起来的免疫化学分析技术克服了上述不足之处，具有高灵敏度、高特 异性、对环境污染小、适于快速检测等优点。迄今，国内外公开报道有关新烟碱类农药的免 疫分析方法如酶联免疫分析法都只是针对一个或两个品种，这主要因为采用的是高特异性 抗体，即该抗体只能识别一个靶标分析物或者只与其结构高度类似物有部分交叉识别（如 氯噻啉抗体对吡虫啉的识别能力最为接近）。若要同时筛查8种新烟碱类农药，则必须进 行7-8轮免疫分析测定，这大大增加了检测时间和成本。因此，为实现新烟碱类农药多残留 的快速检测，需要获得该类农药的通用抗体来建立合适的新烟碱类农药多残留免疫分析方 法。目前国内外有关研制单个新烟碱类农药高特异性抗体的报道已有不少，但有关新烟碱 类农药通用抗体及其通用ELISA检测方法尚未见公开报道。
[0004] 由于免疫细胞库的多样性，淋巴细胞分泌的单抗也是高丰富度的，因此筛选出能 同时识别几个结构类似化合物的通用单克隆抗体是可行的。目前有关农药类特异性通用单 抗的报道，主要集中在有机磷类、拟除虫菊酯类和三嗪类农药，关于新烟碱类农药的通用抗 体制备尚未见公开报道。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种灵敏度高、类选择性强的可同时检测6种新 烟碱类农药的通用单克隆抗体，用于建立灵敏度高、类选择性强的新烟碱类农药多残留免 疫分析方法。
[0006] 为了解决上述技术问题，本发明提供了一种杂交瘤细胞株HO-G12,保藏单位：中 国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC N0:C2015179,保 藏时间2015年10月28号。
[0007] 该细胞株頂I-G12能分泌产生抗6种新烟碱类农药的通用单克隆抗体，抗体亚型 为重链IgGl和轻链lambda。据此建立的间接竞争ELISA法能用于吡虫啉、氯噻啉、噻虫胺、 啶虫脒、噻虫啉和烯啶虫胺这6种氯代烟碱类农药的多残留快速筛查（同时筛查）。
[0008] 在发明过程中，通过分析图1所示的8种新烟碱类农药的化学结构，根据药效团 可以分为N-硝基胍基团类（吡虫啉、氯噻啉、噻虫嗪、噻虫胺和呋虫胺）、N-氰基脒类（啶 虫脒和噻虫啉）和硝基甲撑（烯啶虫胺）。因此，在筛选杂交瘤细胞株的时候，可以采用多 靶标物测试的筛选方式，如优先选择吡虫啉和啶虫脒两个最具代表性的农药（使用也最广 泛）进行同时测试，以期望获得能识别多种新烟碱类农药的通用型单抗。
[0009] 具体如下：
[0010] 本发明提供的杂交瘤细胞株頂I-G12是通过三步ELISA法并结合多靶标物测试的 筛选方式所获得的：第一步，采用基于吡虫啉-OVA包被的间接非竞争ELISA法筛选出能识 别吡虫啉半抗原、而不识别载体蛋白BSA的阳性细胞孔；第二步，采用间接竞争ELISA法对 第一步获得的阳性细胞孔上清进行鉴定，同时以吡虫啉和啶虫脒两种农药为竞争物，挑选 出受两者抑制反应明显（大于50%)并且非竞争对照孔吸光值高（0D>1)的有效细胞孔；第 三步，将第二步获得的细胞孔扩大培养后的上清进行再次鉴定，同时以氯噻啉、噻虫胺、噻 虫啉、烯啶虫胺、呋虫胺和噻虫嗪其它6种新烟碱类农药作为竞争原，通过间接竞争ELISA 法筛选出识别农药种类最多、受抑制程度明显的细胞孔。然后，将此细胞孔经3-4次有限稀 释亚克隆化，采用上述第二步的间接竞争ELISA法进行鉴定，获得能稳定分泌新烟碱类农 药通用单抗的细胞株IMI-G12。该通用单抗的大批量制备可通过细胞株扩大培养并传代、收 集上清并浓缩得到，或者通过细胞株注射小鼠腹腔制备腹水的方式获得。
[0011] 用吡虫啉抗原包被的间接非竞争酶联免疫吸附分析方法（ELISA)测定頂I-G12的 小鼠腹水抗体效价达到了 32, 000 ;进一步利用此新烟碱类农药通用抗体和吡虫啉包被抗 原建立并优化了间接竞争ELISA法，对氯噻啉、吡虫啉、噻虫胺、噻虫啉、啶虫脒和烯啶虫胺 的检测灵敏度1(： 5。(50%抑制浓度）为0.34-3.64即/1^，平均1(：5。为1.721^/1^，是目前公 开报道的识别谱最宽泛的新烟碱类农药通用ELISA法。
[0012] 综上所述，本发明获得了能分泌抗多种新烟碱类农药通用抗体的杂交瘤细胞株， 且相应建立了 6种新烟碱类农药通用ELISA检测技术。采用本发明的新烟碱类农药通用抗 体所建立的ELISA方法，可用于吡虫啉、氯噻啉、噻虫胺、噻虫啉、啶虫脒和烯啶虫胺这6种 氯代烟碱类农药的多残留快速检测，具有灵敏度高、类选择性好、检测通量高、实用性强等 优点。
【附图说明】
[0013] 下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0014] 图1为八种新烟碱类农药的化学结构；
[0015] 图2为间接竞争ELISA法对六种农药的标准曲线。
【具体实施方式】
[0016] 实施例1 :杂交瘤细胞株頂I-G12的制备
[0017] 1.新烟碱类农药人工抗原的制备与动物免疫
[0018] 选用新烟碱类农药的最具代表性品种吡虫啉作为半抗原的起始原料，根 据 Wanatabe 等人(Development of competitive enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) based on monoclonal antibodies for chloronicotinoid insecticides imidacloprid and acetamiprid. Anal Chim Acta, 2001，427(2) :211-219)建立的方法获得 吡虫啉的半抗原，并利用活化酯法制备出吡虫啉-BSA偶联物作为免疫抗原，同时利用混合 酸酐法制备出吡虫啉-OVA偶联物作为ELISA检测抗原。
[0019] 取6-8周龄的Balb/C雌性小鼠3只，将制备的免疫原吡虫啉-BSA与等体积的弗 氏完全佐剂进行预处理（油包水乳化），皮下多点免疫小鼠（100 μ g/只），三周后使用弗氏 不完全佐剂进行加强免疫，然后每隔两周一次加免，小鼠腹腔注射（100 μ g/只）。每次加 免后第8天，小鼠尾巴静脉采血监测效价，采用10 μ g/mL包被酶标板（100 μ L/孔），间接 非竞争ELISA法测定。第3次加免后，3只小鼠的血清效价（即OD值接近1. 0时的抗血清 稀释倍数）均达到了 16, 000以上，同时采用吡虫啉和啶虫脒作为目标分析物进行间接竞争 ELISA法测试，选择效价较高且对上述两种农药识别性能都较高的抗血清对应小鼠优先进 行末免。末免时不加佐剂，直接以生理盐水稀释免疫原吡虫啉-BSA，免疫剂量同上。
[0020] 2.细胞融合与杂交瘤筛选
[0021] 末免后第4天，采用经典的杂交瘤技术将小鼠骨髓瘤细胞SP2/0和免疫脾细胞按 1:5的比例在50% PEG 1450条件下进行细胞融合。当细胞集落长到96孔板底的1/3-1/2面 积大小（细胞融合后第12天左右），首先第一步筛选，采用基于10 μ g/mL吡虫啉-OVA包被 的间接非竞争ELISA法筛选出能识别吡虫啉半抗原、而不识别载体蛋白BSA的阳性细胞孔 (OD 450nniM);第二步，采用5 μ g/mL吡虫啉-OVA包被的间接竞争ELISA法对上述获得的阳性 细胞孔上清进行鉴定，同时以吡虫啉和啶虫脒两种农药（浓度为500ng/mL)为竞争物，挑选 出受两者抑制反应均明显（大于50% )并且非竞争对照孔吸光值较高（0D4Mnni