寡核苷酸接头及其在构建核酸测序单链环状文库中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种寡核苷酸接头和利用该接 头构建核酸测序单链环状文库的方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 第二代测序技术，又称新一代测序技术，是相应于以Sanger测序法为代表的第 一代测序技术而得名。第二代测序中3种主流测序技术分别为依次出现的Roche/454焦磷 酸测序、Illumina/Solexa聚合酶合成测序和ABI/SOLiD连接酶测序技术。与这些主流测序 平台相比较，Complete Genomics (简称CG)测序平台通量最高，每次运行可产生9. 9TB的 数据量，且每小时的产量可以达到50Gb，是目前主流测序平台的10-25倍。CG测序技术可 以实现单倍体读长大于99kb，而目前只有Illumina公司可以实现S-IOkb的单倍体读长，其 他主流的测序公司还不能实现该技术。此外CG测序仪的准确度可达到99. 999 %，优于目前 其他商业化的测序仪。
[0003] 随着第二代高通量测序技术的应用和发展，RNA测序技术也日趋成熟。以Solexa 测序平台为代表的Illumina公司提供的RNA-seq测序技术效果不错，但是由于其构建的是 双链线性测序文库，此类文库并不适合于CG测序平台，同时也存在一些影响实验效率的繁 琐之处，比如在打断后需要用乙醇沉淀回收样品，才能进行后续的逆转录反应，该步骤不仅 影响实验速度，而且增加了操作的复杂度。
[0004] 目前，本领域中尚没有令人满意的用于RNA测序的单链环状文库的构建方法，因 此，本领域迫切需要开发可高效地制备高质量的、可适用于CG测序平台的RNA测序的单链 环状文库的方法。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种高效地制备高质量的、单链环状文库的方法以及用该方 法制备的高质量的单链环状文库。
[0006] 在本发明的第一方面，提供了一种用于构建文库的寡核苷酸接头，该接头包括：第 一接头和弟一接头，
[0007] 其中，第一接头具有式I所示的从5'至3'的结构：
[0008] Z0-Z1-Z2-Z3 (I)
[0009]式中，
[0010] ZO为位于正义链的单链形式的AGACAAGCTC (SEQ. ID. NO. : 1)，并且所述ZO的5'端 是经硫代修饰的；
[0011] Zl为位于正义链的单链形式的标签序列；
[0012] Z2 为双链形式的 GATCGGGCTTCGACTGGAGAC(SEQ. ID. NO. :2);
[0013] Z3为位于正义链的单链形式的核苷酸T。
[0014] 在另一优选例中，所述的标签序列是长度为6-12个碱基的核苷酸序列。
[0015] 在另一优选例中，所述的标签序列是长度为6-10个碱基的核苷酸序列。
[0016] 在另一优选例中，所述的标签序列的核苷酸序列与ZO的序列不同。
[0017] 在另一优选例中，所述的寡核苷酸接头的所述的第二接头具有式II所示的从5' 至3'的结构：
[0018] Z4-Z5 (II)
[0019] 式中，
[0020] Z4为位于反义链（即互补链）的单链形式的核苷酸T ;
[0021] Z5 为双链形式的 AGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGA (SEQ. ID. NO. : 3)。
[0022] 在本发明的第二方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒中含有容器以及位于所述 容器中的本发明的第一方面中所述的用于构建文库的寡核苷酸接头。
[0023] 在另一优选例中，所述的第一接头和第二接头位于相同或不同的容器中。
[0024] 在本发明的第三方面，提供了一种构建测序文库的方法，所述的方法包括步骤：
[0025] (a)对双链DNA片段进行末端修复，从而获得平末端的DNA片段；
[0026] (b)对所述平末端的DNA片段的3'端添加碱基A，从而获得3'端加 A的DNA片 段；
[0027] (c)对所述3'端加A的DNA片段，用本发明第一方面所述的接头进行连接反应，从 而获得两端加接头的DNA片段；
[0028] ⑷将所述两端加接头的DNA片段作为模板，用特异性引物对进行PCR扩增，从而 获得DNA扩增产物，其中所述引物对中的一条引物标记有生物素；
[0029] (e)对上一步骤中得到的所述DNA扩增产物，用包被有亲和素的珠子通过"亲和 素-生物素"的结合进行分离，从而捕获有生物素标记的PCR扩增产物；
[0030] (f)对上一步骤中被捕获的带有生物素标记的PCR扩增产物，进行单链化处理，从 而获得单链DNA ;
[0031] (g)对上一步骤中得到的所述单链DNA，在单链环化分子的存在下，进行单链环化 反应，从而获得含环化产物的混合物，即为测序文库。
[0032] 在另一优选例中，步骤（c)中，所述的两端加接头的DNA片段具有式III所示的结 构：
[0033] K1-K2-K3 (III)
[0034] 式中
[0035] Kl为具有式I所示的从5'至3'的结构的第一接头：
[0036] Z0-Z1-Z2-Z3 (I)
[0037] K3为具有式II所示的从5'至3'的结构的第二接头：
[0038] Z4-Z5 (II)
[0039] K2具有式IV所示的从5'至3'的结构；
[0040] Z3a-Z6-Z4a (IV)
[0041] 上述各式中，
[0042] Z3a为位于反义链的单链形式的核苷酸A ;
[0043] Z4a为位于正义链的单链形式的核苷酸A ;
[0044] Z6为待测序片段的序列；
[0045] Z0、Zl、Z2、Z3、Z4、Z5具有如上所述的定义。
[0046] 在另一优选列中，所述方法具有选自下组的一个或多个特征：
[0047] (i)所述亲和素为链霉亲和素；
[0048] (ii)步骤（d)中，所述的引物对包括：
[0049] 正向引物：5-/phos/AGACAAGCTCNNNNNNNNNNGATCGGGCTTCGACTGGAGAC(SEQ ID NO. :4)和
[0050] 反向引物：5-/bio/TCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACT(SEQ ID NO. :5);
[0051] 其中，5_/phos/表TK 5'末端核苷酸经过磷酸化修饰，5_/bio/表TK 5'末端核苷酸 经过生物素标记；
[0052] (iii)步骤（g)中，所述的单链环化分子的序列为 TCGAGCTTGTCTTCCTAAGACCGC(SEQ ID NO. :6)；
[0053] (iv)步骤（h)中，所述的核酸酶为外切酶；
[0054] (V)步骤（h)中，所述的核酸酶为特异性切割单链和双链线性DNA的外切酶；
[0055] (vi)所述的外切酶包括Exo I和Exo III的混合酶。
[0056] 在另一优选例中，步骤（a)中的所述的双链DNA片段是通过如下步骤制备的：
[0057] (a0)对mRNA样本进行片段化处理，从而获得片段化的mRNA ;
[0058] (al)对所述片段化的mRNA进行反转录，从而获得cDNA扩增产物，作为双链DNA片 段。
[0059] 在另一优选例中，所述双链DNA片段直接由DNA样本进行片段化处理后而获得。
[0060] 在另一优选例中，所述方法还包括步骤：
[0061] (h)对上一步骤中所述的混合物，用特异性切割线性DNA的核酸酶进行消化处理， 从而获得未环化的DNA片段被消化的混合物，其中上一步骤所述混合物中含有未消化的环 化产物；和
[0062] (i)任选地将上一步骤中所述未环化的DNA片段被消化的混合物进行纯化，从而 获得纯化的RNA测序单链环状文库。
[0063] 在另一优选例中，步骤（e)中，所述亲和素为链霉亲和素。
[0064] 在另一优选例中，步骤（d)中，所述的引物对包括：
[0065] 正向引物：5-/phos/AGACAAGCTCNNNNNNNNNNGATCGGGCTTCGACTGGAGAC(SEQ ID NO. :4)和
[0066] 反向引物：5-/bio/TCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACT(SEQ ID NO. :5)，
[0067] 其中，5_/phos/表TK 5'末端核苷酸经过磷酸化修饰，5_/bio/表TK 5'末端核苷酸 经过生物素标记。
[0068] 在另一优选例中，步骤（g)中，所述的单链环化分子的序列为 TCGAGCTTGTCTTCCTAAGACCGC(SEQ ID NO. :6)。
[0069] 在另一优选例中，步骤（h)中，所述的核酸酶为外切酶。
[0070] 在另一优选例中，步骤（h)中，所述的核酸酶为特异性切割单链和双链线性DNA的 外切酶。
[0071] 在另一优选例中，所述的外切酶包括Exo I和Exo III的混合酶。
[0072] 在本发明的第四方面，提供了一种测序文库，所述的测序文库中的待测序分子具 有式πι所示的结构：
[0073] K1-K2-K3 (III)
[0074] 式中，
[0075] Kl为具有式I所示的从5'至3'的结构的第一接头：
[0076] Z0-Z1-Z2-Z3 (I)
[0077] K3为具有式II所示的从5'至3'的结构的第二接头：
[0078] Z4-Z5 (II)
[0079] K2具有式IV所示的从5'至3'的结构；
[0080] Z3a-Z6-Z4a (IV)
[0081] 上述各式中，
[0082] Z3a为位于反义链的单链形式的核苷酸A ;
[0083] Z4a为位于正义链的单链形式的核苷酸A ;
[0084] Z6为待测序片段的序列；
[0085] Z0、Zl、Z2、Z3、Z4、Z5具有如上所述的定义；
[0086] 并且待测序分子是环化的，并且所述待测序分子仅具有正义链或仅具有反义链。
[0087] 在另一优选例中，所述的测序文库中，所有的待测序分子为环化形式，并且所有的 待测序分子仅具有正义链。
[0088] 在另一优选例中，所述的测序文库中，所有的待测序分子为环化形式，并且