一种衰老控制microRNA530基因及其转基因植物和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种衰老控制micr〇RNA530基因及其转 基因植物和应用。
【背景技术】
[0002] 植物衰老是一个复杂的过程，它是在植物内源基因的控制和外界环境的影响下发 生的一种自然衰退和死亡的过程。植物的衰老体现在叶片的衰老与凋亡上，在叶片衰老的 过程中，植物所储备的营养物质从叶片流向种子或果实，或被存储于植物的根、块茎等器官 中，为来年的生长提供足够的物质支持。对于大多数农作物来说，植物的早衰对于其产量和 品质都有极大的不利影响。前人调查表明，由生物或非生物胁迫引起的叶片早衰会使作物 品质下降，减产 50% (Navabpour et al·，2003, J Exp Bot, 54(391) :2285 ~2292)。在农 业生产实践中，延缓叶片衰老，可使农作物贮存更多的物质和能量，为粮食增产和品质提升 提供保障。随着全球人口的持续增长，粮食危机日益加剧。水稻作为世界三大粮食作物之 一，是全世界25亿以上的人口的主食。因此，培育具有较高抗性、生育期适当延缓的水稻新 品系对解决全球粮食危机具有重要意义。
[0003] 植物的衰老受到多种环境因素的影响。植物衰老的内源环境因子主要是指叶龄 和植物激素。不同类型的植物激素对植物衰老的影响不同。乙烯、茉莉酸、脱落酸和水杨 酸能够显著促进植物的衰老，而生长素、细胞分裂素、赤霉素则能够显著抑制植物的衰老。 外界环境因子，如干旱、低温、弱光、臭氧、营养缺乏和病原菌侵染等也会引起植物的早衰 (Thomas et al., 2013, New Phytol, 197(3):696-711 ；ffu et al. , 2012, J Integr Plant Biol，54(12):936-952;Zhang and Zhou，2013，Plant MolBiol，82(6):539-545)〇
[0004] 在已经建立的植物衰老调控网络中，转录因子处于核心位置。它们感受上游衰 老信号的诱导，然后作用于下游大量衰老效应基因，从而调控植株的衰老进程（Balazadeh et al·，2008, Plant Biol，10:63_75)。对拟南芥（van der Graff et al·，2006, Plant Physiol, 141:776-792)、水稻（Liu et al.，2008,Plant MolBiol，67:37-55)、小麦 (Gregersenet al·，2008, Plant Biol, 10:37-49)等植物衰老调控的转录组分析发现许多 转录因子的表达在衰老过程中发生了显著变化。随后对部分转录因子的功能进行分析，结 果发现NAC、WRKY家族的转录因子参与了植物衰老的调控（Balazadeh et al.，2008, Plant Biol (Stuttg), 10(Suppl I):63-75 ；Breeze et al. , 2011, Plant Cell, 23(3):873-894 ； Zentgraf et al.,2010, Eur J Cell Biol, 89(2-3) :133-137 ；Zhou et al., 2011,Mol Cells, 31 (4) :303-313)。
[0005] 表观遗传调控，包括组蛋白修饰和染色质重塑，也被证明参与了植物衰老的调 控。组蛋白去乙酰化酶AtHDl和HDA6突变后，将会导致植株早衰、延缓开花（Pandey et al.,2002, Nucleic Acid Res,30:5036-5055；ffu et al. , 2008, J Exp Bot,59:225-234) 〇 组蛋白甲基化需要组蛋白甲基化转移酶HMT的参与。一个SU(VAR)3-9(KMTase 1)类型的 HMT蛋白SUVH2的过量表达会导致植株叶片发育异常和衰老延缓（Ay et al.，2009, Plant J，58:333-346)，这是由于在过表达植株中，与叶片衰老调控相关基因 WRKY53相关位点 上形成了 H3K27双甲基化及三甲基化的表观遗传标记，导致这些染色质标记与WRKY53 无法被诱导表达。对衰老叶片中细胞核染色质的细胞学观察发现，衰老过程中细胞核染 色质组织结构发生了显著变化（Kolodziejek et al.，2007，Protoplasma, 232:97-108; Damri et al·, 2009, Rejuvenation Res, 12:435-443)，这暗不 了 染色质重塑因子参与 了植物衰老的调控。SWI/SNF(mating type switching/non fermenting)类染色质 重塑因子不同亚基的突变将会导致植株发育的异常（Sarbiwski et al.，2005，Plant Cell, 17:2454-2472)。染色质结构调控蛋白ORESARA 7(0RE7)在染色质重塑调控的植物 衰老过程中具有重要作用，该基因突变后，将会使植物晚花并且叶片发育异常（Weigel et al.，2000 ;Plant Physiol, 122:1003-1013)，过量表达后，则会使叶片衰老显著延缓（Lim et al·，2007, Plant J，52:1140-1153)。目前虽然没有直接证据表明DNA甲基化也参与了 植物衰老的调控，但是对矮牵牛和辐射松发育过程甲基化的研究则表明，随着发育过程的 进行，植株个体内甲基化水平逐渐提高（Prakash et al·，2003, J Exp Bot, 54:1361-171; Fraga et al. , 2002, Planta, 215:672-678)〇
[0006] miRNA是真核生物中一种长约20~24bp的内源非编码RNA，它能通过对特定靶 基因的切割降解或翻译抑制从而实现对靶基因的沉默作用。研究表明，多个miRNA参与了 植物衰老过程的调控。拟南芥miR164表达被抑制后，植株的衰老进程加快（Kim et al.， 2009, Science, 323:1053-1057)。与之相反，过量表达miR319则会使植株的衰老大大延 缓（Schommer et al·，2008, PlosBiol, 6:e230)。miR390 能够通过反式激活 siRNA TAS3 的产生，引起生长素应答因子ARF2/3/4的降解，从而调控了植物的衰老过程（Adenot et al.，2006, CurrBiol, 16:927-932 ;Fahlgren et al.，2006, CurrBiol, 16, 939-944) 〇
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是针对上述问题，提供一种有效延缓植物衰老的衰老控制 microRNA530基因及其转基因植物和应用。
[0008] 为达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：本发明的一种衰老控制 microRNA530成熟体基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
[0009] 本发明的一种衰老控制microRNA530前体基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所 不。
[0010] 进一步地，所述衰老控制microRNA530前体基因的核苷酸序列包括在SEQ ID NO. 2 所示的核苷酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因 或衍生物的核苷酸序列。
[0011] 本发明的一种含有所述的衰老控制microRNA530基因的核苷酸序列的质粒或植 株过量表达载体或宿主细胞。
[0012] 本发明的一种延缓衰老的转基因植物的制备方法，包括如下步骤：
[0013] (1)获得衰老控制micr〇RNA530前体基因的核苷酸序列；
[0014] (2)用RT-PCR获得衰老控制microRNA530前体基因片段；
[0015] (3)构建衰老控制microRNA530前体基因的植株过量表达载体；
[0016] (4)将步骤（3)得到的植株过量表达载体转化农杆菌；
[0017] (5)将带有转化植株过量表达载体的农杆菌转化目标植物。
[0018] 进一步地，在步骤（1)中，通过网站找到衰老控制microRNA530前体基因的核苷酸 序列如SEQ ID NO. 2所示；
[0019] 在步骤（2)中，利用PCR的方法扩增出衰老控制microRNA530前体基因的核苷酸 序列；
[0020] 所述引物包括上游引物和下游引物；所述带有BamHl酶切位点的上游引物具有 SEQ ID NO :3的核苷酸序列，所述带有Spel酶切位点的下游引物具有SEQ ID NO :4的核苷 酸序列；
[0021] 以反转录得到的水稻日本晴幼叶cDNA为模板，利用上述引物在Takara Ex Taq的 作用下扩增目的片段，PCR反应条件是94°C预变性3分钟；94°C 1分钟，54°C 30秒，72°C 20 秒，30个循环，72 °C后延伸10分钟；
[0022] 将扩增产物回收纯化后，连接到pMD19-T Simple载体，筛选阳性克隆并测序，获得 所需衰老控制micr〇RNA530基因片段；
[0023] 在步骤（3)中，得到的阳性克隆pMD19-〇sa-miR530cDNA用BamHI和SpeI双酶切， 回收插入片段；
[0024] 并用同样的方法酶切pCAMBIA1390_ubi的植物表达载体，回收载体片段；用回收 的插入片段和载体片段做连接反应，转化大肠杆菌DH5a，通过酶切筛选阳性克隆，获得植株 过量表达载体，载体命名为pCAMBIA1390-ubi-〇sa-miR530 ;
[0025] 在步骤（4)中，将pCAMBIA1390-ubi-〇sa-miR530植株过量表达载体转化至根癌农 杆菌EHA105菌株中；
[0026] 在步骤（5)中，通过农杆菌介导的目标植物遗传转化体系将其导入到水稻品种日 本晴中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、移