一种定量检测赭曲霉毒素a的方法

文档序号:9642265阅读:407来源:国知局
一种定量检测赭曲霉毒素a的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及定量检测赭曲霉毒素 A的方法,尤其涉及一种适配体生物传感器结合 血糖仪定量检测赭曲霉毒素 A的方法,属于赭曲霉毒素 A的定量检测领域。
【背景技术】
[0002] 霉菌毒素(mycotoxins)主要是指霉菌或真菌在其所污染的食品中产生的有毒代 谢产物,它们可通过饲料或食品进入人和动物体内,引起人和动物的急性或慢性毒性,损害 机体的肝脏、肾脏、神经组织、造血组织及皮肤组织等。常见的霉菌毒素有黄曲霉毒素、赭曲 霉毒素、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、T-2、HT-2毒素、伏马菌素等。其中赭曲霉毒 素 A(OTA)主要侵害动物肝脏与肾脏,主要是引起肾脏损伤,大量的毒素也可能引起动物的 肠黏膜炎症和坏死。国际癌症研究机构(IARC)将OTA列为II B类致癌物。因此,世界各国 都很重视赭曲霉毒素的检测和控制,相应的制定出了赭曲霉毒素的限量标准。
[0003] 适配体与抗体的性质相似,但适配体特异性更强,对目标靶分子具有更高的亲和 力,更容易获得,在体外可以大量快速的合成,制备方法也更为简单,可以针对不同种类的 目标物进行筛选。目前,基于适配体检测赭曲霉毒素 A的方法有已有报道。但是,很多检测 方法存在所需试剂多,操作繁琐,检测周期长,重现性差,设备昂贵,前处理复杂等缺点,不 利于进行现场检测。
[0004] 血糖仪是一种测量血糖水平的电子仪器,由于其体积小,成本低,操作简单,能够 得到准确的定量结果,已经得到广泛应用。然而,血糖仪只能检测葡萄糖这一种物质,并且 检测范围是0. 6~33mmol/l (10~600mg/dl)。因此,开发一种便携式适配体生物传感器结 合血糖仪定量检测赭曲霉毒素 A这种非葡萄糖物质的方法,将具有广泛的应用前景。

【发明内容】

[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种定量检测赭曲霉毒素 A的方法,该方法利 用适配体生物传感器结合血糖仪定量检测赭曲霉毒素 A,具有操作简便,检出限低,特异性 好,重复再现性好等优点。
[0006] 为解决上述技术问题,本发明所采取的技术方案是:
[0007] 本发明首先公开了赭曲霉毒素 A的适配体,其核苷酸序列为SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4 或 SEQ ID NO. 5 所示。
[0008] 所述适配体的互补DNA,其核苷酸序列为SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8、 SEQ ID Nd 9 或 SEQ ID Nd 10 所示。
[0009] 本发明进一步公开了一种定量检测赭曲霉毒素 A的方法,包括以下步骤:(1)制备 适配体生物传感器;(2)提取待测样品中的赭曲霉毒素 A,得到样品提取液,加入到所述适 配体生物传感器中,混匀,孵育;(3)分离上清液,加入过量蔗糖溶液进行反应;(4)用血糖 仪进行定量检测。
[0010] 其中,步骤(1)所述适配体生物传感器按照以下方法制备:(a)活化蔗糖酶;(b) 活化所述互补DNA ; (c)将步骤(a)活化后的蔗糖酶与步骤(b)活化后的互补DNA分别洗 涤,然后混匀,反应合成DNA-蔗糖酶聚合物;(d)将链霉亲和素修饰的磁球链接所述赭曲霉 毒素 A的适配体;(e)将步骤(c)合成的DNA-蔗糖酶聚合物洗涤后固定在步骤(d)处理的 磁球上,即得。
[0011] 步骤(b)所述互补DNA的3'端进行巯基修饰;步骤(d)所述赭曲霉毒素 A的适配 体的3'端进行生物素修饰。
[0012] 步骤(a)所述活化鹿糖酶是将鹿糖酶与sulf〇-SMCC(sulfosuccinimidyl-4-( N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate)反应;其中,所述反应的体系包括: 300-500 μ I 20mg/ml蔗糖酶,0. 5-2mg sulfo-SMCC ;所述反应的条件为:先涡旋震荡5min, 然后在恒温混匀仪上室温反应l-3h ;
[0013] 优选的,所述反应的体系包括:400 μ I 20mg/ml鹿糖酶,Img sulfo-SMCC ;所述反 应的条件为:先涡旋震荡5min,然后在恒温混匀仪上室温反应2h。
[0014] 步骤(b)所述活化互补DNA是将所述互补DNA与TCEP (Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride)反应;其中,所述反应的体系包括:80_120μ1 100μΜ互补 DNA,1-3 μ 1 0.1 M缓冲液Β,1-3 μ I 30mM TCEP ;所述反应的条件为:恒温混匀仪上室温反 应 0· 5-2h ;
[0015] 优选的,所述反应的体系包括:100μ1 100μΜ互补DNA,2yl 0.1 M缓冲液Β,2μ1 30mM TCEP ;所述反应的条件为:恒温混匀仪上室温反应Ih ;所述缓冲液B包括:0.1 M氯化 钠,0.1 M磷酸钠,质量比为0.05 %的吐温-20, pH = 7. 3。
[0016] 步骤(c)所述洗涤包括:将步骤(a)反应后的溶液离心,取上清液,加入到超滤管 Amicon-100K,25°C、12000rcf离心10min,用缓冲液A洗涤;将步骤(b)反应后的溶液离心, 取上清液,加入到超滤管Amicon-3K中,25°C、12000rcf离心10min,用缓冲液A洗涤;其中, 所述缓冲液A包括:0.1 M氯化钠,0.1 M磷酸钠 ,pH = 7. 3 ;步骤(c)所述反应合成DNA-蔗 糖酶聚合物的条件是恒温混匀仪上室温反应24-60h,优选为48h。
[0017] 步骤(d)所述链接的体系包括:0. 5_2ml lmg/ml链霉亲和素修饰的磁球, 40-80 μ 1 0.1 mM所述赭曲霉毒素 A的适配体;所述链接的条件为:恒温混匀仪上室温反应 1-2h ;
[0018] 优选的,所述链接的体系包括:1ml lmg/ml链霉亲和素修饰的磁球,60 μ 1 0.1 mM 所述赭曲霉毒素 A的适配体;所述链接的条件为:恒温混匀仪上室温反应Ih ;
[0019] 步骤(e)所述洗涤是将步骤(c)合成的DNA-鹿糖酶聚合物用超滤管Amicon-IOOK 于25°C、12000rcf离心10min,用缓冲液A洗涤(所述缓冲液A包括:0.1 M氯化钠,0.1 M磷 酸钠 ,pH = 7. 3);步骤(e)所述固定是将洗涤后的DNA-鹿糖酶聚合物与步骤(d)处理的磁 球混合,在恒温混匀仪上室温反应l_3h,优选为lh。
[0020] 本发明定量检测赭曲霉毒素 A的方法中,步骤(2)将样品提取液加入适配体生物 传感器中,使适配体生物传感器的终浓度为3mg/ml ;所述孵育的条件为:室温孵育60min ; 步骤(3)所述反应的条件为:室温反应30min ;所述分离上清液是将反应后的溶液用磁分离 器分离,然后吸取上清液;步骤(4)所述定量检测是根据血糖仪的读数与赭曲霉毒素 A标准 品的浓度作回归方程,将待测样品的血糖仪读数带入回归方程,计算待测样品中赭曲霉毒 素 A的浓度;其中,所述待测样品包括食品或饲料。
[0021] 本发明针对赭曲霉毒素 A分别合成了 5条适配体序列及不同适配体序列相对应的 互补DNA序列(适配体序列SEQ ID NO. 1,其对应的互补DNA核苷酸序列为SEQ ID NO. 6 ; 适配体序列SEQ ID NO. 2,其对应的互补DNA核苷酸序列为SEQ ID NO. 7;依此类推。);其 中,SEQ ID NO. 5所示适配体序列与SEQ ID NO. 4所示序列的差异在于SEQ ID NO. 5所示 序列后多加12个A碱基。
[0022] 本发明分别用不同适配体序列及其互补DNA序列合成适配体生物传感器,比较不 同适配体序列的血糖仪信号值。结果表明,当OTA的浓度为25 μ M,SEQ ID NO. 1-4所示适 配体序列所产生的血糖仪信号值分别为13mg/dl、15mg/dl、16mg/dl、19mg/dl;SEQIDN0·5 所示适配体序列加了 12个A碱基以后血糖仪的信号值为65mg/dl。可能是由于添加12个 A碱基以后,适配体序列的3'端与磁球结合,增大了适配体与磁球之间的空间位置,适配体 能更好的与OTA分子结合,释放下来更多的蔗糖酶分子,血糖仪的信号值明显增加。因此, 本发明赭曲霉毒素 A适配体的核苷酸序列优选为SEQ ID NO. 5所示,其互补DNA的核苷酸 序列为SEQ ID NO. 10所示。
[0023] 本发明适配体生物传感器检测赭曲霉毒素 A的原理包括,链霉亲和素包被的磁球 与生物素修饰的适配体相结合,蔗糖酶和互补DNA相结合;将DNA-蔗糖酶聚合物通过互补 DNA与适配体碱基互补配对的原则固定到磁球表面;当溶液中含有所需检测目标分子时, 目标分子与适配体特异性结合,从而将DNA-蔗糖酶聚合物从磁球上释放到溶液中;用磁分 离器分离溶液,释放到溶液中的DNA-蔗糖酶聚合物能够高效水解蔗糖为葡萄糖,从而通过 血糖仪进行定量检测。由于被释放到溶液中的DNA-鹿糖酶聚合物的量能够通过葡萄糖的 量来表示,并且蔗糖酶的量与样品中目标分子的量存在一定的比例关系。因此,血糖仪的读 数能够被用来定量目标分子的浓度。本发明适配体生物传感器4°C条件下能有效保存10天 以上。
[0024] 本发明对定量检测赭曲霉毒素 A的方法中步骤(2)的孵育时间和步骤(3)的反应 时间进行了优化,结果表明,适配体生物传感器与OTA分子的孵育时间在60min时,蔗糖酶 已经基本全部释放,为了保证蔗糖酶完全释放,选择60min作为孵育时间;为了保证血糖仪 有一个明显的检测信号,采用30min作为与蔗糖溶液的反应时间。
[0025] 检出限测定结果表明,本发明方法检测赭曲霉毒素 A的最低检出限为 6. 7 X 10 9M(2. 69 μ g/kg)。中国所采用的GB 2715-2005《粮食卫生标准》中谷类和豆类中赭 曲霉毒素 A的最高限量为5 μ g/kg,CAC(国际食品法典委员会)中规定的小麦、大麦、黑麦 中的赭曲霉毒素 A的最高限量为5 μ g/kg,EC (欧盟委员会)中规定的速溶咖啡和葡萄干中 赫曲霉毒素 A的最尚限量为10 μ g/kg,婴幼儿食品中赫曲霉毒素 A的最尚限量为0. 5 μ g/ kg。因此,本发明方法的检出限除了婴幼儿食品基本能满足检测要求。
[0026] 重复实验结果表明,本发明适配体生物传感器检测赭曲霉毒素 A具有良好的再现 性。特异性分析结果表明,OTA适配体能特异性识别OTA分子,不与其他干扰因
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