一种培育抗虫转基因玉米的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种培育抗虫转基因玉米的方法。
【背景技术】
[0002] 目前在植物转基因育种中所应用的外源基因如Bt、EPSPS等，大多来自原核生物， 由于原核生物基因自身的特点，如DAT含量较高，超过60%，造成基因表达的mRNA在植物 体内极易被降解；2)存在类似真核基因的内含子切点、转录终止子序列，造成转录不完整、 mRNA异常剪切等；3)密码子与植物密码子存在较大差异，造成蛋白翻译效率降低；4)其结 构与植物等真核生物差异显著，如不含有真核生物基因的5' -UTR序列和3'末端的polyA 加尾序列，导致基因在植物体内往往表达水平较低。例如，来自于苏云金芽孢杆菌的野生型 杀虫蛋白基因在植物中的表达量非常低，其表达的毒蛋白只占总蛋白的0.001%或者几乎 检测不到。
[0003] 玉米螟是世界性的主要玉米害虫，每年因玉米螟危害造成玉米产量损失在5%左 右。我国是玉米螟的多发和重发区，20世纪70年代以来，几乎每两年就大发生一次，年损失 玉米380-640万吨，相当于一个中等玉米省的产量。
[0004] 由于玉米的内源抗虫性是受多基因控制的，且心叶期靶标害虫和穗期靶标害虫基 因各自独立遗传，用常规育种方法培育抗螟杂交种不仅周期长，而且很难获得兼抗两个世 代玉米螟的亲本。同时，玉米抗螟基因很有可能与高产性状呈负相关，20年来各国抗螟育种 均未取得明显进展。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种培育抗虫转基因玉米的方法。
[0006] 本发明所提供的培育抗虫转基因玉米的方法包括将抗虫基因导入目的玉米，得到 表达所述抗虫基因的转基因玉米的步骤；所述转基因玉米与所述目的玉米相比，抗虫性提 高；所述抗虫基因是编码序列9所示蛋白质的基因。
[0007] 其中，所述抗虫基因可先进行如下修饰，再导入宿主中，以达到更好的表达效果：
[0008] 1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所 偏爱的密码子，在保持抗虫蛋白的氨基酸序列不变的同时改变其密码子以符合植物偏爱 性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中 导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35%、多于45%、多于50%或多于约60% ;2)修 饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序 列进行修饰；3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可 包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动 子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特 异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的 许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子 用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；4)与适合的转 录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS 的E9 ;任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；5)引入 增强子序列，如内含子序列（例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列（例如来源于 TMV，MCMV 和歷）。
[0009] 本发明中，所述抗虫基因具体为下述下述a)或b)或C)的DNA分子：
[0010] a)核苷酸序列如序列表中序列3所示；b)核苷酸序列如序列表中序列3的第 1-2007位所示；c)核苷酸序列与序列表中序列3或序列3的第1-2007位至少具有98%的 同一性，且编码序列9所示蛋白质（命名为CrylAh蛋白）。
[0011] 在本发明的一个实施例中，所述将抗虫基因导入目的玉米是通过将表达所述抗虫 基因的重组DNA片段导入所述目的玉米完成的。
[0012] 所述重组DNA片段通过重组表达载体导入所述目的玉米。
[0013] 本发明中所述重组DNA片段均指能够在宿主细胞中表达序列表中序列9所示蛋白 质的DNA，该DNA不但可包括启动所述抗虫基因转录的启动子，还可包括终止子。进一步，所 述重组DNA片段还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动 子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。如花椰菜花叶病毒的组成型启动子 35S ;西红柿蛋白酶抑制剂II启动子（PIN2)或LAP启动子（均可用茉莉酮酸曱酯诱导）；热 休克启动子；四环素诱导型启动子；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子PF128， 种子IC存蛋白质特异的启动子，例如，菜豆球蛋白、napin, oleosin和大豆beta conglycin 的启动子等。可用于本发明的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子（NOS 终止子）、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸 和章鱼氨酸合酶终止子。
[0014] 可用现有的植物表达载体构建表达所述抗虫基因的所述重组表达载体。所述植 物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pROKII、pBin438、 PCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA139卜Xa 或 pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司）等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3'端非翻译区 域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸 信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3'端，如农杆菌冠癭瘤诱导（Ti)质粒基因（如胭 脂合成酶Nos基因）、植物基因（如大豆贮存蛋白基因）3'端转录的非翻译区均具有类似功 能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强 子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列 的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广 泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
[0015] 在本发明的一个实施例中，所述重组DNA片段和所述重组表达载体中启动所述抗 虫基因转录的启动子为Ubi启动子；所述Ubi启动子的序列为序列表中序列6,或与序列6 至少具有80%的同一性，且具有启动子功能。
[0016] 在本发明的一个实施例中，所述重组DNA片段和所述重组表达载体中终止所述抗 虫基因转录的转录终止序列如序列表中序列7所示，或与序列7至少具有80%的同一性，且 具有转录终止功能。
[0017] 在本发明的一个实施例中，所述重组DNA片段和所述重组表达载体中还包括由Ω 序列和Kozak序列顺次连接而成的OMK序列；所述OMK序列如序列表中序列5所示，或与序 列5至少具有80%的同一性，且具有增强子功能。
[0018] 在本发明的一个实施例中，所述重组DNA片段由所述Ubi启动子、所述OMK序列、 所述抗虫基因和所述转录终止序列顺次连接组成，命名为Ub i-OMK-mCry IAh-Po IyA-T-NOS， 其序列为序列表中序列11。
[0019] 在本发明的一个实施例中，所述重组表达载体含有所述重组DNA片段，将该重组 表达载体命名为PS3300-UMG2-UC2A，其序列为序列表中序列12。
[0020] 其中，序列3由2010个核苷酸组成，其末尾处为两个终止密码子，编码序列表中序 列9所示的CrylAh蛋白。序列5由67个核苷酸组成。序列6由2009个核苷酸组成。序 列7由488个核苷酸组成。序列9由668个氨基酸组成。序列11由4605个核苷酸组成，其 中第1-2009位为Ubi启动子序列，第2010-2076位为OMK序列，第2083-4092位为mCyrIAh 序列，第4118-4605位为转录终止序列。序列12由15099个核苷酸组成，其中第151-2159 位为Ubi启动子序列，第2160-2226位为OMK序列，第2233-4242位为mCyrlAh序列，第 4268-4755位为转录终止序列。
[0021 ] 所述重组表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒栽体，直接DNA转化，微注射，电 穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞。
[0022] 利用本发明所提供的培育抗虫转基因玉米的方法培育得到的抗虫转基因玉米也 属于本发明的保护范围。所述转基因玉米包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
[0023] 在本发明的一个实施例中，所述玉米具体为玉米HiII。在本发明中，所述抗虫具体 为抗玉米螟。
[0024] 实验证实，本