利用重组谷氨酸棒杆菌联产1，3-丙二醇和谷氨酸的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物化工领域，具体涉及一种利用重组谷氨酸棒杆菌联产1，3-丙二 醇和谷氨酸的方法。
【背景技术】
[0002] 1，3_丙二醇是一种重要的化工原料，可作为有机溶剂应用于油墨、印染、涂料、润 滑剂、抗冻剂等工艺领域，其最主要的用途是作为聚酯和聚氨酯合成的单体，特别是与对苯 二甲酸聚合生成聚对苯二甲酸丙二酯（PTT)。PTT与PET (聚对苯二甲酸乙二醇酯）、PBT (聚 对苯二甲酸丁二醇酯）相比具有更优良的性能，例如更好的耐污染性、韧性和回弹性以及 抗紫外性能等，此外还具有耐磨、吸水性低、低静电等优点。因此PTT被认为是PET的升级 产品，具有广阔的市场前景。
[0003] 目前，1，3-丙二醇的生产方法主要包括化学法和生物法。化学法通常是以环氧丙 烷或者丙烯为原料通过复杂的催化过程合成1，3-丙二醇。化学合成法的缺点是副产物多， 选择性差，操作条件需高温高压，设备投资巨大，原料为不可再生资源等。因此，化学法生产 1，3-丙二醇的工艺技术路线目前基本已经淘汰。
[0004] 现有的生物法生产1，3-丙二醇主要包含两条技术路线：一、以甘油为原料利用天 然微生物生产1，3-丙二醇；二、以葡萄糖为原料利用重组大肠杆菌生产1，3-丙二醇。具体 介绍如下。
[0005] 工业上利用甘油生产1，3_丙二醇的工艺主要采用克雷伯氏肺炎杆菌（如中国专 利CN200810105722. 8)。工艺路线的主要缺点是：1、克雷伯氏肺炎杆菌为条件致病菌，其生 产过程中生物安全性需要严格控制；2、大量副产物如乙酸、乳酸，丁二酸，2, 3-丁二醇的合 成，使得整个后提取过程变得十分复杂；3、1，3-丙二醇的得率低，通常1，3-丙二醇对甘油 的质量得率低于40%。
[0006] 针对技术路线二，自然界不存在可以直接转化葡萄糖生成1，3_丙二醇的微生 物。杜邦公司通过在大肠杆菌内外源表达来自酿酒酵母的甘油合成途径（甘油3-磷酸 脱氢酶及甘油3-磷酸酶）和来自克雷伯氏肺炎杆菌的甘油脱水酶及其激活因子并利用 大肠杆菌自身的NADPH依赖的醇脱氢酶YqhD，实现了从葡萄糖到1，3-丙二醇的一步转化 (CN200380104657. 2)。这一工艺路线的缺点是重组大肠杆菌需要大量的基因工程改造，同 时1，3_丙二醇对葡萄糖的质量得率低，通常在25% -40%之间，大肠杆菌的发酵培养需要 使用昂贵的原料酵母粉。
[0007] 因此有必要提供一种新的工艺简便、副产物少、生物安全性高的新的1，3_丙二醇 生产工艺。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷，提供一种新的利用重组谷氨 酸棒杆菌联产1，3-丙二醇和谷氨酸的方法。
[0009] 为达到以上目的，本发明提供了一种利用重组谷氨酸棒杆菌发酵联产1，3-丙二 醇和谷氨酸的方法，包括通过以下步骤获得重组谷氨酸棒杆菌：1)在谷氨酸棒杆菌中引入 1，3_丙二醇脱氢酶的编码基因；2)在谷氨酸棒杆菌中引入1，2_丙二醇脱水酶及其激活因 子的编码基因或者引入甘油脱水酶及其激活因子的编码基因。
[0010] 优选的，为了获得更好的技术效果，进一步提高1，3-丙二醇和谷氨酸的产量，所 述方法还包括敲除谷氨酸棒杆菌的内源IdhA基因。
[0011] 可选的，所述1，3-丙二醇脱氢酶的编码基因如SEQ ID NO. 1所示，所述1，2-丙二 醇脱水酶及其激活因子的编码基因如SEQ ID NO. 2所示，所述甘油脱水酶及其激活因子的 编码基因如SEQ ID NO. 3所示。
[0012] 可选的，所述方法包括构建含有1，3_丙二醇脱氢酶的编码基因和1，2_丙二醇脱 水酶及其激活因子的编码基因的重组质粒，或者，构建含有1，3_丙二醇脱氢酶的编码基因 和甘油脱水酶及其激活因子的编码基因的重组质粒。
[0013] 可选的，所述重组质粒还含有Iac启动子。
[0014] 可选的，对所述重组谷氨酸棒杆菌进行好氧发酵生产1，3_丙二醇和谷氨酸。
[0015] 可选的，所述好氧发酵的发酵培养基包含糖、甘油、KH2P04、MgS0 4、MnS04、FeSO4、玉 米浆、（NH4) 2SO4、盐酸硫胺素、和维生素 B12。
[0016] 可选的，所述好氧发酵的发酵培养基中各组分的含量为：糖10_150g/L、甘油 10-50g/L、KH 2PO4 0.5-5g/L、MgSO4 0.2-5g/L、MnSO4 0.001-lg/L、FeSO4 0.001-lg/L、玉米 浆 l-50g/L、（NH4)2SO4 l-20g/L、盐酸硫胺素 0· 001-lg/L、维生素 B12 0· 001-lg/L。
[0017] 可选的，所述好氧发酵的条件包括：
[0018] 所述谷氨酸棒杆菌的接种量为1-20体积％ ;发酵温度为28-35Γ ;通过流加氨水 控制pH值在5-8之间；通过改变转数控制溶氧值在10%以上。
[0019] 其中，发酵到残糖接近于Og/L时结束好氧发酵过程。
[0020] 可选的，所述方法包括在发酵结束后收集发酵液，对所述发酵液进行硫酸酸化 结晶获得谷氨酸晶体和第二处理发酵液，再对所述第二处理发酵液进行浓缩精馏获得1， 3_丙二醇。
[0021] 其中，发酵结束后的菌体可以作为产品，用在饲料添加剂当中。
[0022] 本发明还提供了一种重组谷氨酸棒杆菌，在所述重组谷氨酸棒杆菌中：
[0023] 1)含有1，3-丙二醇脱氢酶的编码基因；
[0024] 2)含有1，2-丙二醇脱水酶及其激活因子的编码基因或者甘油脱水酶及其激活因 子的编码基因；
[0025] 3)内源IdhA基因被敲除。
[0026] 本发明所提供的方法的有益效果在于：（1)采用了谷氨酸棒杆菌为生产菌株，解 决了生物安全性的问题，降低了菌体处理的成本。同时发酵过程中的菌体可以作为产品，用 在饲料添加剂当中。（2)充分耦联谷氨酸和1，3_丙二醇生产过程，使得还原力得到充分利 用。在不降低谷氨酸得率的同时，获得极高的1，3_丙二醇对甘油的质量转化率（大于70%， 接近理论转化率）。（3)副产物少，分离过程得到简化。
【附图说明】
[0027] 图1为质粒pEC-dhaT-pdu的质粒图谱。
【具体实施方式】
[0028] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例 中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0029] 实施例1
[0030] 过表达1，2-丙二醇脱水酶及其激活因子以及1，3-丙二醇脱氢酶基因的重组质粒 pEC-dhaT-pdu 构建。
[0031] 以克雷伯氏肺炎杆菌HR526的基因组为模板，以引物pdu_F(tgcctgcaggtcgactc tagTTAAGCATGGCGATCCCGAAATGG)和 pdu-R(CGCCCGCtaaAAGGAGATATACCATGAGATCGAAAAGAT TTGAAG)为引物进行PCR，获得包括1，2-丙二醇脱水酶及其激活因子的pdu⑶EGH操纵子 片段（pdu⑶EGH序列如SEQ ID NO. 2所示）并进行PCR产物纯化（天根生物PCR产物纯 化试剂盒）。以克雷伯氏肺炎杆菌HR526的基因组为模板，以引物dhaT-F(ATATCTCCTTtta GCGGGCGGCTTCGTATA)和 dhaT-R(ctatgacatgattacgaattAAGGAGATATACCatgAACAACTTTAATC TGCAC)为引物进行PCR，获得1，3-丙二醇脱氢酶基因 dhaT片段（序列如SEQ ID NO. 1所 示）并进行纯化（天根生物PCR产物纯化试剂盒）。将大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭质粒 pEC-K18mob2 (Journal of Biotechnology 104(2003)287-299)用 EcoRI 和 XbaI 进行双酶 切，利用GibsonAssembly试剂盒（NEB)将pduCDEGH操纵子片段和dhaT片段一步连接到 pEC-K18mob2上，获得的重组质粒命名为pEC-dhaT-pdu(质粒图谱见附图1).该质粒利用 Iac为启动子，无需添加外源的诱导剂即可过表达dhaT及pdu⑶EGH基因。
[0032] 实施例2
[0033] 乳酸脱氢酶基因 IdhA的敲除。
[0034] 以谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组为模板，以引物ldhA-up_F(ctatgacatgatta cgaattAAAACAGCCAGGTTAGCAGCC)和 ldhA-up-R(CGCCAAAGATTTTCGATCCCACTTCCTGATTTCCC) 为引物进行PCR，获得IdhA上游约500bp的同源片段ldhA-up并进行PCR产物纯化。以谷 氨酸棒杆菌 ATCC13032 的基因组为模板，以引物 ldhA-down-F(GGGATCGAAAATCTTTGGCGCCTA GTTGGC)和 ldhA-up-R(ccgggtaccgagctcgaattGAGAATTTCGGCGTGCTCG)为引物进行 PCR，获 得IdhA下游约500bp的同源片段ldhA-down并进行PCR产物纯化。将谷氨酸棒杆菌自杀性 质粒pK18mobsacB(Journal of Biotechnology 104(2003)287-299)用 EcoRI 进行单酶切， 利用 GibsonAssembly 试剂盒（NEB)将 ldhA-up 和 ldhA-down 片段一步连接到 pK18mobsacB 上，获得的重组质粒命名为pK18-ldhA。利用电穿孔仪（伯乐）将pK18-ldhA通过电转化转 入到谷氨酸棒杆菌ATCC13032中，电击条件为电压2. 5KV，电阻600 Ω，电容25 μ F(电击杯 宽度为2mm)。一次重组菌在含25mg/L的卡那霉素 LB平板上筛选。该重组菌进一步在液体 LB培养基里过夜培养，之后在含有100g/L的蔗糖LB平板上进行二次筛选。利用ldhA-up-F 和ldhA-down-R为引物进行菌落PCR，敲除IdhA基因的重组子克隆出来的片段为1Kb，该重 组菌命名为 C. glutamicum Δ ldhA。
[0035] 实施例3
[0036] 表达1，2-丙二醇脱水酶及其激活因子以及1，3-丙二醇脱氢酶基因的重组谷氨酸 棒杆菌的构建。
[0037] 利用电穿孔仪（伯乐）将pEC-dhaT-pdu通过电转化转入到谷氨酸棒杆菌野生菌 ATCC 13032以及乳酸脱氢酶IdhA敲除的重组菌C. glutamicum Δ IdhA中，电击条件为电 压2