Tmem176a基因启动子区dna甲基化检测的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及甲基化检测技术，具体来说涉及到TMEM176A基因启动子区DNA甲基化 检测，特别是一种用于检测TMEM176A基因启动子区甲基化状态的甲基化引物对，进一步包 括非甲基化引物对。同时，本发明还涉及含有所述引物对的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 食管癌是全世界范围内致死率最高的恶性肿瘤之一，在常见肿瘤中排第八位，在 消化道肿瘤中排第四位。尽管随着临床肿瘤学的不断发展进步，食管癌仍然是癌症相关死 亡率最主要的原因之一。食管癌主要包括食管鳞状细胞癌和食管腺癌两种，其发病率有很 大的地区差异，高发地带主要有非洲南部和东部、亚洲中部和东部，从伊朗北部到中亚共和 国一直延伸到中国北部和中部被称为"食管癌带"，男女发病无差异。据统计，仅2012年就 有456000例新发食管癌患者，有400000例食管癌患者死亡。中国是食管癌的高发地区，其 发病率和死亡率分别为22. 4/100000和16. 77/100000,90%为食管鳞状细胞癌，主要与吸 烟、饮酒、营养状况差、蔬菜和水果摄入量少以及进食过烫的食物有关。食管腺癌主要在西 方发达国家较常见，主要与胃食管反流病、巴雷特食管、吸烟、肥胖、果蔬摄入少以及幽门螺 旋杆菌感染史相关。食管癌的整体预后较差，5年生存率不超过20%。早期食管癌一般是无 症状的，但是，随着内镜诊断技术的不断改进，使得早期食管癌的胃镜检出率提高了。吞咽 困难是中晚期食管癌最常见的症状，可伴随体重下降。胃镜检查虽然能够较直观的观察食 管粘膜病变，但最终确诊还是依赖于胃镜下胃组织的病理活检及切除标本的病理诊断。食 管癌目前的治疗主要包括单纯外科手术、外科手术联合化疗、放疗或放化疗，其5年生存率 依次为16% -52%、23% -36%、18. 6% -41. 3%、39%;对于不能切除的食管癌，以单纯放化 疗为主，但对维持症状缓解率、改善长期生存率的效果非常有限，因此，食管癌的预后不良。
[0003] 结直肠癌是世界第三大恶性肿瘤，在世界恶性肿瘤相关死亡病因中排名第四。每 年大约有120万新发病例被诊断为结直肠癌，60万病例死于结直肠癌。在男性患者常见肿 瘤中，结直肠癌居第三位，而在女性患者中居第二位。根据美国癌症协会（American Cancer Society，ACS) 2014公布的权威数据表明结直肠癌是美国男性和女性总第三大最常见的癌 症和第三大癌症死亡原因，近20年来结直肠癌的发病率及死亡率呈明显下降趋势。而我 国2014年公布的最新数据表明男性结直肠癌的发病率和死亡率在肺癌、胃癌、肝癌及食管 癌之后，位列第5。女性结直肠癌的发病率和死亡率居于乳腺癌、肺癌之后，为第3。全国肿 瘤登记中心在2011年和2013年收集全国登记处肿瘤登记资料，分析2003-2007年和2009 年全国肿瘤登记覆盖地区癌症的发病和死亡水平，结果显示2003~2007年中国结直肠癌 发病率为28. 08/10万；癌死亡率为13. 41/10万。2009年中国结直肠癌发病率为29. 44/10 万；癌死亡率为14. 23/10万。由此可见我国结直肠癌的发病率和死亡率逐年上升，应加强 结直肠癌的综合防治工作，提高结直肠癌的早诊早治水平。
[0004] 鉴于目前应用于临床的食管癌和结直肠癌的诊断和治疗手段，尤其是对肿瘤的早 期诊断、残留病灶及复发的检测方法仍然十分有限，是目前迫切需要解决的问题。因此，发 现食管癌和结直肠癌的早期诊断和治疗的有效方法具有十分重要的意义。
[0005] 随着后基因组时代的到来，表观遗传学（Epigenetics)已成为生命学科的研究前 沿。表观遗传学是针对遗传学而言的，是指研究DNA序列不发生改变的可遗传的基因表达 变化的科学，它可以解释一些经典遗传学所不能解释的问题，例如：单卵双生的兄弟具有完 全相同的基因型，并在同样的环境下成长，但仅其中一人患胃癌，而另外一人身体健康，因 此表观遗传信息提供了何时、何地以何种方式去应用遗传信息的指令。在消化系肿瘤领域 中，表观遗传学研究主要集中DNA甲基化及组蛋白乙酰化上。DNA甲基化修饰是基因组表 观遗传调控中主要的方式，人类肿瘤的发生、发展与DNA甲基化的异常有关，基因启动子区 CpG岛高甲基化可导致抑癌基因表达沉默进而导致肿瘤发生。DNA甲基化是指在甲基化转 移酶的作用下，以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，将甲基转移到CG二核苷酸胞嘧啶的5号 碳原子上，形成5甲基胞嘧啶。DNA甲基化异常是细胞癌变过程中早期、频发事件，因此特 异基因的甲基化可作为癌症早期诊断的分子标志物、治疗靶点和判断预后手段。随着技术 的进步，检测甲基化的手段也丰富起来，不仅可探测某段DNA序列的甲基化分布，而且还能 大通量的了解整个基因组的甲基化程度。目前主要方法有两类：一是亚硫酸氢钠法（Sodium Bisulfite)，包括亚硫酸氢钠法依赖的基因测序法、亚硫酸氢钠联合限制性内切酶分析法 (C0BRA)、甲基化特异性PCR(MS-PCR)、甲基化敏感的单核苷酸扩增法（Ms-SNuE)等；另一类 是甲基化敏感的限制性内切酶法，包括Southern法、甲基化敏感的限制性图谱（MSRF)、限 制性标记基因组扫描技术（RLGS)、差异性甲基化杂交分析（DMH)、甲基化CpG岛扩增子分析 (MCA)等。值得一提的是MS-PCR，自1996年Herman发明了此项技术后，大大简化了 DNA甲 基化的检测方法，使得表观遗传学研究更加迅速的向前发展，其突出的优点在于高特异性、 高灵敏度、操作简便、费用及耗时均较少、不受限制性内切酶的限制，目前MS-PCR已成为用 以研究基因甲基化状态的应用最为广泛的方法，尤其对于大批的临床标本甲基化状态的 研究更是首选方法。MS-PCR的基本原理是：DNA经过亚硫酸盐硫化修饰后，CpG岛上没有发 生甲基化的CG二核苷酸中的胞嘧啶就转化为尿嘧啶，最后转化为胸腺嘧啶，而发生甲基化 的胞嘧啶则保持不变，因此针对上述区别分别设计甲基化引物及非甲基化引物，分别进行 PCR扩增，扩增产物行凝胶电泳照相观察结果，得出是否为甲基化的结论。
[0006] 跨膜蛋白 176 (transmembrane protein 176, TMEM176)是与跨膜蛋白 4A 家族 (membrane-spanning 4A family of protein，MS4A)相关的蛋白，存在于哺乳动物和骨鱼 类，包括TMEM176A和176B两种亚型。ZuccoIo等在斑马鱼中发现了大量的高度保守的 TMEM176基因。TMEM176A最早是在小鼠的肾脏近端小管细胞内发现的，位于6号染色体。而 人类TMEM176A基因位于7q36. 1，有四个跨膜结构域，最早是在肝细胞癌中筛选肿瘤相关抗 原发现的。Gehrau等发现当肝移植患者复发丙型肝炎感染时，TMEM176A的mRNA转录水平明 显增加。Condamine等研究发现TMEM176A与176B是相互作用的，二者在维持小鼠幼稚树突 状细胞的未成熟状态中起着重要作用，炎症刺激使TMEM176A和176B表达下调。Cuajungco 等发现TMEMl76A与176B在人类很多组织中都有明显的表达，在淋巴瘤和肺癌中，TMEMl76A 的蛋白水平表达明显增加。Strelnikov等报道人类TMEM176A和176B的CpG岛异常的DNA 甲基化与乳腺癌有关。综上所述，目前对TMEM176A的功能研究还存在很多的不足，其在食 管癌的表观遗传学改变和功能研究尚未见报道。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供检测细胞TMEM176A基因启动子区甲基化状态的引物，即用 于检测TMEM176A基因启动子区甲基化状态的引物，同时，本发明另一目的是提供一种含有 所述引物的试剂盒。本发明的又一目的是提供一种检测TMEM176A基因启动子区甲基化状 态的方法，以此来对食管癌、结直肠癌进行风险评估。
[0008] 经过反复的试验与推敲，本发明人选出一对特异性很好的甲基化引物对及非甲基 化引物对，并且建立了一个稳定的反应体系，摸索出理想的反应条件，应用敏感度较高的丙 烯酰胺凝胶电泳技术作为结果的检出手段，因此得出可靠的实验结果，结果表明：TMEM176A 基因启动子区的高甲基化状态在食管癌和结直肠癌中具有较高的特异性。利用所述引物 对及试剂盒检测TMEM176A基因甲基化状态的灵敏度高，解决了上述检出率低、结果难以分 析、仅能显示大体的基因学异常等一系列技术问题，因此，本发明所述的引物及试剂盒可用 于食管癌和结直肠癌的早期诊断、疗效判定等。
[0009] 本发明提供的技术方案是：用于检测细胞TMEM176A基因启动子区甲基化 状态的引物对，其为甲基化引物，其上游引物核苷酸序列如Primer-MF所述，即： 5' GAAGAAAGACGTTTTGTGGATAGGAC 3'，下游引物核苷酸序列如 Primer-MR 所述，艮P : 5' CTAATATCCGCTCTACTCGACCGCG 3'。利用该甲基化引物对，以硫化修饰后的DNA为模板进 行MS-PCR扩增。如果TMEM176A基因启动子区存在甲基化，则会得到156bp大小的片段； 如果TMEM176A基因正常即未甲基化，则不产生扩增产物。基于此，本申请将该引物对称为 甲基化引物。所述甲基化引物对，其上游引物的Tm 59. 17, GC含量42%，下游引物的Tm 63. 86, GC 含量 56%。
[0010] 本发明还涉及下述非甲基化引物对，其上游引物核苷酸序列如Primer-UF所述， 艮P :5' GGAAGAAAGATGTTTTGTGGATAGGAT 3'，下游引物核苷酸序列如 Primer-UR 所述，即： 5' CAACTAATATCCACTCTACTCAACCACA 3'。利用该非甲基化引物对，以硫化修饰后的DNA为 模板进行MS-PCR扩增，如果TMEM176A基因正常即未甲基化，则会得到160bp大小的片段。 基于此，本申请将该引物对称为非甲基化引物。所述非甲基化引物对，其上游引物的Tm 57. 86, GC含量37%，下游引物的Tm 59. 58, GC含量39%。
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