一种运用pcr引物检测长芒苋的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及使用PCR技术检测植物及植物产品中长芒苋（Amaranthus palmeri S. Watson)的方法，属于有毒有害杂草检测领域。
【背景技术】
[0002] 苋属（Amaranthus)隶属苋科（Amaranthaceae)，为一年或两年生雌雄同株或异株 草本植物，世界上共有苋属植物近70种（包括栽培品种）。苋属里雌雄同株种类分布广泛， 适生温带、暖温带、亚热带及热带地区，是生物量最大分布最广泛的杂草类群之一。雌雄异 株种类主要分布于北美，19世纪初随着人类贸易活动陆续在欧洲出现。苋属杂草给生态系 统和农业生产造成一定的危害。自1985年雌雄异株种类（长芒苋A. palmeri)在中国首次 发现以来，我们又在山东、辽宁、福建、江苏等口岸进境的货物种子中检测到长芒苋、西部苋 (A. rudis)、糖果苋（A. tuberculatus)、反枝苋（A. retroflexus)、绿糖苋（A. hybridus)、刺 苋（A. spinosus)、白苋（A. albus)等苋属杂草种子，其中检疫性杂草长芒苋、西部苋、糙果 苋在新生境具极强的适生能力与入侵性，具有较高的危害风险。
[0003] 鉴于我国粮谷进口量大，几乎每批均有苋属杂草种子检出。而苋属种子小型， 长约1mm，形态特征相近，难以区分，口岸鉴定工作缺乏基本技术资料。除国内印丽萍 (1997)、郭琼霞（1998)等对苋属与藜属部分种类的种子，及国外Kowal (1954)、Klopper和 Robel (1989)、Esparza-Sandoval 等（1996)、Costea (1997)等人对苋属种子外部形态进行 的微形态研究外，中国苋属杂草种子形态学鉴定资料很少。
[0004] 长芒苋为重要的异株苋亚属检疫性杂草，该种为一年生草本。高0.8-2m(原产地 可高达3m)。茎直立，粗壮，具棱角，黄绿色，具绿色条纹，有时变淡红褐色，无毛或上部被 稀疏柔毛，分枝斜升。叶无毛，叶片卵形至菱状卵形，茎上部叶呈披针形，长（2-) 5-8cm，宽 (0. 5-) 2-4cm，先端钝、急尖或微凹，常具小突尖；基部楔形，略下延，边缘全缘。穗状花序 生于茎顶和侧枝顶部，直立或俯垂，长（7-) 10-25cm，宽1-1. 2cm，下部花序也见团簇状。苞 片长4-6cm，雄花中脉伸出呈芒刺状，雄花花被片5,内侧花被片长2. 5-3mm，钝状至微凹， 外侧花被片长3. 5-4_，渐尖，具显著伸出的中脉；雄蕊5 ;雌花苞片更坚硬，雌花花被片5， 略外展，不等长，最外一片具宽阔中脉，倒披针形，长3-4mm，先端急尖，其余花被片匙形，长 2-2. 5mm，先端截形至微凹，有时呈啮齿状；花柱2 (3)。胞果近球形，长I. 5-2mm，果皮膜质， 周裂。种子近圆形或宽椭圆形，直径长1-1. 2_，深红褐色，具光泽。
[0005] 长芒苋尚未有准确、快速的检测鉴定方法，为此，本文将在前人研究基础上，对长 芒苋进行分子检测研究，为口岸长芒苋检测、鉴定工作提供技术支持。
【发明内容】
[0006] 本发明收集国内目前已入侵我国的检疫性杂草长芒苋及其20种苋属种子（见表 1)，建立了快速简便、特异性强、准确可靠的长芒苋分子检测方法，能将长芒苋准确鉴定出 来。该方法检测快速，方法可靠，整个过程在一个工作日内完成，可有效在口岸检测中推广 应用。
[0007] 具体技术方案如下：
[0008] 本发明目的是提供一种检测长芒苋基因组DNA的PCR方法，它包括如下步骤： [0009] (1)植物基因组DNA的提取；
[0010] (2)长芒苋的特异引物，序列如下：
[0011] PALF ：TGGTACAGGTAGGGA AGA
[0012] PALR ：ACATAAAATATTACAAATCGACGCA
[0013] 该引物用于长芒苋基因组DNA特异性检测，扩增片段约为262bp。
[0014] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明建立了快速简便、特异性强、准确 可靠的长芒苋分子检测方法，能将长芒苋与苋属其他种区别开来。该方法检测快速，方法可 靠，整个过程在一个工作日内完成，可有效在口岸检测中推广应用。
[0015] 下面结合附图与【具体实施方式】对本发明作进一步详细描述。
【附图说明】
[0016] 图1 :长芒苋基因组DNA特异引物的扩增 图2 :长芒苋基因组DNA特异引物的扩增
【具体实施方式】
[0017] 实施例1 :植物材料基因组DNA的提取
[0018] 本实验苋属种子源于天津出入境检验检疫局动植食中心植检实验室。共计21种， 相关信息见表1。
[0019] 表1供试材料代码、拉丁名、中文名及收集年份
[0022] 使用消毒镊子挑取植物种子，将每颗苋属种子放入I. 5mL
[0023] 离心管，每管加入0. 03g石英砂，液氮研磨，按照QIAGEN公司生产的DNA提取试剂 盒提取DNA，并将DNA溶于100 μ L I X TE缓冲液中，置于-20 °C保存。
[0024] 实施例2 :特异引物的设计
[0025] 人工合成长芒苋的特异引物，引物序列如下：
[0026] PALF ：TGGTACAGGTAGGGA AGA
[0027] PALR ：ACATAAAATATTACAAATCGACGCA
[0028] 实施例3 :长芒苋特异引物的PCR扩增
[0029] 1.反应混合液的配制
[0030] 反应体系配置见表2。
[0031] 表2糙果苋特异性扩增体系
[0033] 2. PCR反应程序
[0034] 预变性：94°C，3min
[0035] 变性：94 °C，30s
[0036] 退火：57°C，30s
[0037] 延伸：68°C，30s
[0038] 循环数：40个
[0039] 延伸：68°C，5min
[0040] 2· 3结果分析
[0041] 对21个实验材料的基因组DNA进行特异性引物PALF/PALR的扩增，以添加 无菌水为模板作为阴性对照。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色均能观察到特 定目的大小带，通用引物扩增的片段应约为262bp，只有长芒苋显示特定大小的目的 带（见图 1 和图 2 中 2 泳道），A. aernicola, A. tuberculatus, A. rudis, A. greggii，A. fimbriatus,A. deflexus,A. standieyanus, A. tamaulipensis, A. paniculatus,A. crispus, A. polygonoides, A. powellii, A. quitensis, A. Hybridusj A. viridis, A. albus, A. blitoides，A. blitum，A. wrightii和阴性对照无相应产物（见图I中3~18泳道 和图2中3~8泳道，图1中3~18泳道分别为A. aernicola，A. tuberculatus，A. rudis, A. greggii, A. fimbriatus, A. deflexus, A. standleyanus, A. tamaulipensis, A. paniculatus，A. crispus，A. polygonoides，A. powellii，A. quitensis，A. hybridus 和阴性 对照，图 2 中 3 ~8 泳道分别是 A. viridis，A. albus，A. blitoides，A. blitum，A. wrightii 和阴性对照），图I和图2中I泳道为2000bp DNA marker。
【主权项】
1. 一种运用PCR引物检测长芒苋的方法，其特征在于，所设计的引物和用途如下： 长芒苋的特异引物，序列如下： PALF：TGGTACAGGTAGGGAAGA PALR：ACATAAAATATTACAAATCGACGCA 扩增片段约为262p，用于长芒苋基因组DNA特异性检测。2. -种运用PCR引物检测长芒苋的方法，其特征在于，它包括如下步骤： (1) 植物基因组DNA的提取； (2) 建立长芒苋基因组DNA的PCR检测方法， 长芒苋特异引物序列如下： PALF：TGGTACAGGTAGGGAAGA PALR:ACATAAAATATTACAAATCGACGCA。3. 根据权利要求1或2所述的一种运用PCR引物检测长芒苋的方法，其特征在于，该方 法以及所设计的1套引物在检测长芒苋方面的应用。
【专利摘要】本发明涉及使用PCR技术检测植物及植物产品中长芒苋(Amaranthus？palmeri)的方法，属于有毒有害杂草检测领域。本发明设计合成了长芒苋的特异性引物，用于对长芒苋基因组DNA的特异检测。本发明建立了一种快速简便、特异性强、准确可靠的长芒苋的分子检测方法，一个工作日内完成整个检测。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105400869
【申请号】CN201510701508
【发明人】廖芳, 郭京泽, 姜一
【申请人】天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心
【公开日】2016年3月16日
【申请日】2015年10月26日