荧光定量pcr法检测top2a基因表达的引物、探针及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学、生物技术以及临床分子诊断技术领域，特别是涉及荧光 定量PCR法检测T0P2A基因 mRNA表达的引物、探针及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，在西方国家其发病率和病死率居肿瘤之首。 近年来，在我国发病率也呈直线上升的趋势，目前浸润性乳腺癌已被视为全身性疾病，其预 后的判断及与预后相关的生物学标志物备受关注，由于许多患者亚临床转移灶，以及化疗 耐药的出现，导致患者无瘤生存期缩短，检测有关乳腺癌耐药相关基因，对指导规范化治疗 尤为重要。
[0003] 在乳腺癌的研究中发现，TOPO II α的基因表达和肿瘤细胞对拓朴异构酶抑制剂 的敏感性明显相关，Τ0Ρ2Α基因异常的病人可以明显受益于含有拓朴异构酶抑制剂的辅助 化疗方案，Τ0Ρ2Α高表达的病人使用CEF方案进行治疗可以降低61 %的复发风险和51 %的 死亡风险，而Τ0Ρ2Α低表达的患者使用CEF方案只能降低6%的复发风险和10 %的死亡风 险。
[0004] TOP2A 基因 （Topoisomerase II alpha，TOP II α )定位于 l7qll. 2_22 区域，编码 DNA拓朴异构酶II α，是核基质成分之一，在核内发挥作用，能调节核酸空间结构动态变 化，参与DNA的复制、转录、重组及修复过程。
[0005] 依托泊苷为细胞周期特异性抗肿瘤药物，作用于DNA拓扑异构酶II，形成药 物-酶-DNA稳定的可逆性复合物，阻碍DNA修复。研究发现，依托泊苷的敏感性依赖于其 细胞TOPO II α蛋白的表达水平。TOPOII α高表达的患者可以从依托泊苷治疗中获益。 因此使用Τ0Ρ2Α基因 mRNA水平来评判患者对含蒽环类药物治疗方案，更为准确。
[0006] 目前用于检测T0P2AmRNA水平的方法主要有免疫组织化学法，该方法检测时间 长，判读受主观因素影响大，不能准确反映 T0P2A的表达水平；而cDNA微阵列mRNA表达谱 分析（基因芯片）方法又存在灵敏度低、易污染等问题。
【发明内容】
[0007] 为了解决现有技术中的上述问题，本发明提供了一种荧光定量检测T0P2A基因 mRNA的引物对和Taqman探针，特异性强、灵敏度高，重复性好。
[0008] 本发明提供的荧光定量检测T0P2A基因 mRNA的引物对A和Taqman探针A，其引物 对A的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1~2所示，Taqman探针A的核苷酸序列如SEQ ID NO: 3 所示。
[0009] 本发明采用荧光PCR结合Taqman探针法，基于荧光定量PCR技术来检测T0P2A的 基因表达水平，设计了目的基因的cDNA扩增引物和特异性Taqman探针，当然地，Taqman探 针的5'端标记有焚光报告基团，3'端标记有焚光淬灭基团。本发明优选报告基团为FAM， 淬灭基团为MGB。引物和探针的核苷酸序列具体为：
[0010] 引物对 A :F :5'-AAGTTACCTGAAGCTC-3'（SEQ ID N0:1);
[0011] R :5' -GGAAGGTGTTTTTAG-3'（SEQ ID N0:2);
[0012] Taqman 探针 A :5' FAM-TCCCCTCTGAATT-MGB3'（SEQ ID N0:3)。
[0013] 本发明还提供了一种荧光定量PCR法检测T0P2A基因表达的试剂盒，其包括以上 所述的荧光定量检测T0P2A基因的引物对A和Taqman探针A。
[0014] 优选地，上述试剂盒中，还包括用于检测内参基因 B2M mRNA的引物对B和Taqman 探针B，引物对B的核苷酸序列如SEQ ID N0:4~5所示，Taqman探针B的核苷酸序列如 SEQ ID NO:6所示。优选Taqman探针B的报告基团为FAM，淬灭基团为MGB。选择内参基 因 B2M的目的是为了增加检测的准确性。相较于其它内参基因，实验表明，B2M较GAPDH及 GUSB等为内参的肿瘤和正常组内及组间的表达差异最小，稳定性最佳。
[0015] 引物对 B :F:5' -ATGCTTATACACTTACA-3'（SEQ ID N0:4)，
[0016] R:5' -ACATGGACATGATCTTC-3，（SEQ ID N0:5);
[0017] Taqman 探针 B :5'FAM-GTAGGGTTATAATA-MGB 3'（SEQ ID N0:6)。
[0018] 优选地，上述试剂盒中，还包括B2M标准品、T0P2A标准品。T0P2A标准品为含有梯 度浓度T0P2A基因组质粒DNA的溶液，B2M标准品为含有梯度浓度B2M基因组质粒DNA的 溶液，标准品是作为该试剂盒的阳性对照及用于标准曲线的制作。
[0019] 优选地，上述试剂盒中，还包括第一链cDNA合成体系，具体包括反转录酶1~5U、 反转录10XRT Buffer适量、dNTPs 1~2mM、T0P2A基因反转录引物对1~10pM、内参基 因 B2M反转录引物对1~10pM，用DEPC水补足至19. 5 μ L ;使用时加入样本RNA0. 5 μ g。其 中两基因的反转录引物可以根据需要自行设计，或直接购买商品，只要能够获得其对应的 cDNA即可，无其他要求。10XRT Buffer为反转录PCR缓冲液，可直接购买市售商品。
[0020] 优选地，上述试剂盒内共有五管试剂，分别为：
[0021 ] 第一链cDNA合成体系；
[0022] 荧光定量PCR检测反应液：含有TaqDNA聚合酶1~2U、2. 0~5. OmmolMgCljP 0· 2 ~0· 8mmol dNTPs 的 Premix ;引物对 A 1 ~IOpM ;Taqman 探针 A 1 ~IOpM ;引物对 B 1 ~IOpM Jaqman 探针 B 1 ~IOpM ;DEPC 水适量；
[0023] T0P2A 标准品；
[0024] B2M 标准品；
[0025] 阴性对照品：DEPC水。
[0026] 本发明所述的A和B仅用于区别不同的引物对和探针，并没有其他特别的意义。
[0027] 本发明还提供了以上任一所述的荧光定量PCR法检测T0P2A基因表达的试剂盒的 使用方法，其包括以下步骤：
[0028] (1)以肿瘤组织和癌旁正常组织为待检样品，提取待检样品中的RNA，反转录成样 品 cDNA ;
[0029] (2)以样品cDNA作为模板，用引物对A、Taqman探针A、引物对B和Taqman探针B 进行荧光定量PCR反应；T0P2A标准品和B2M标准品也分别进行与样品cDNA同样的操作， 并根据T0P2A标准品和B2M标准品绘制标准曲线；
[0030] (3)结果分析：分析标准曲线的R2在0. 99以上，T0P2A基因和B2M基因扩增效率 应在90-100%范围，再根据荧光定量PCR仪器给出的Ct值，进行如下计算：
[0031] Λ Ct (肿瘤组织）=Ct (待检肿瘤组织样品）-Ct (B2M基因）；
[0032] Λ Ct (癌旁正常组织）=Ct (待检癌旁正常组织样品）-Ct (B2M基因）；
[0033] ΛΛ Ct = Λ Ct (肿瘤组织）-Λ Ct (癌旁正常组织）；
[0034] 相对表达率=2 ΔΔ %相对表达率> 1判断为乳腺癌Τ0Ρ2Α基因高表达。
[0035] 优选地，上述使用方法中，步骤（2)中荧光定量PCR反应程序为：95°C预变性 2min ;95°C 15s，60°C 30s 40个循环；当荧光基团选择FAM时在60°C 30s时采集荧光信号。
[0036] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0037] 本发明提供的荧光定量检测T0P2A基因 mRNA的引物对和Taqman探针，特异性强、 灵敏度高，重复性好。基于此的荧光定量检测试剂盒，也具有特异性强、灵敏度高、重复性好 等特点，同时还具有定量准确、预混酶、速度快、全封闭反应等优点：
[0038] 1、操作性：操作简便，一步加样，无需将样本与酶混合，从样本提取到出检测报告 只需要2小时。
[0039] 2、灵敏度：该试剂盒可对Ing的样本进行有限扩增，检测结果可信。
[0040] 3、特异性：设计的上下游引物均为特异性引物，使用Taqman探针法进行定量，具 有很尚的特异性。
[0041] 4、准确度：以正常组织作为定量媒介，同步PCR反应过程，在同等实验条件下的测 量实现Ct值相互比较，可以减少实验过程造成的误差，实现荧光定量PCR检测T0P2A基因 的mRNA水平检测。
[0042] 5、应用范围：本发明的能检测新鲜冰冻组织、石蜡包埋样本、血液，具有较高的灵 敏度及特异性，临床适用范围宽。
【附图说明】
[0043] 图I :T0P2A标准曲线图；
[0044] 图2 :B2M标准曲线图；
[0045] 图3 :T0P2A低表达扩增曲线图。
【具体实施方式】
[0046] 下面结合优选的具体