ra机器（Luminex Corporation) 上，通过计算每孔中100个事件，测定分离的Axin2蛋白的量。试验化合物对端锚聚合酶 的抑制作用导致较高水平的Axin2,其与可检测荧光的增加直接相关。作为对照，仅用溶剂 (中性对照）和用端锚聚合酶参考抑制剂IWR-2 (3E-06 M)(其指作为对Axin2的最大增 加的对照）处理细胞。为了分析，将获得的数据针对未处理的溶剂对照标准化并使用Assay Explorer软件（Accelrys)进行拟合，以确定EC 5q值。
[0123] PARPl测定的描述 PARP-I的生物化学活性测试：自动聚ADP核糖化测定 自动聚ADP核糖化测定以两个步骤进行：酶促反应（其中His-标记的Parp-I将生物 素化ADP-核糖/ADP-核糖由作为共同底物的生物素化NAD/NAD转移至其自身）和检测反 应（其中分析了结合于酶的His标签的穴状化合物标记的抗-His抗体和结合生物素-聚 ADP核糖化残基的)(1 ent?标记的-链霉抗生物素之间的时间分辨FRET)。自动聚ADP核糖 化活性可经由HTRF信号的增加直接检测。
[0124] 自动聚ADP核糖化测定作为格雷纳低量nb 384-孔微量滴定板中的384-孔HTRF? (Cisbio, Codolet, France)测定形式进行。在试验化合物（10倍稀释浓度）不存在或存 在下，将 35 nM His-标记的 Parp-I (人，重组体，Enzo Life Sciences GmbH, L5rrach, Germany)和作为共同底物的 125 nM bio-NAD (Biolog, Life science Inst. , Bremen, Germany)和 800 nM NAD 的混合物以总体积 6 μL (100 mM Tris/HCl、4 mM 氯化镁、0. 01 % IGEPAL? CA630、lmM DTT、0. 5 % DMS0, pH 8、13 ng/μL 激活的DNA (BPS Bioscience, San Diego, US))于23°C孵育150 min。通过加入4 μL的终止/检测溶液（70 nM SA-Xlent? (Cisbio, Codolet, France)、2· 5 nM抗 _His_K? (Eu-标记的抗-His, Cisbio, Codolet, France)在下列中：50 mM HEPES, 400 mM KF、0.1 % BSA、20 mM EDTA, pH 7.0)终止反 应。于室温下孵育I小时后，用Envision多模阅读器（Perkin Elmer LAS Germany GmbH) 以激发波长340 nm (激光模式）和发射波长615 nm和665 nm测量HTRF。测定发射信 号的比率。所用的全值为无抑制剂的反应。所用的药理学零值为在1 μΜ的最终浓度中的 Olaparib (LClabs, Woburn, US)。抑制值（IC50)使用程序 Symyx Assay Explorer? 或者 来自 GeneData 的 Condosseo? 测定。
[0125] TNKSl 和 TNKS2 ELISA 测定的描述 TNKS 1和2的生物化学活性测试：活性ELISA (自动聚ADP核糖化测定） 为分析TNKS 1和2的自动聚ADP核糖化活性，进行活性ELISA :在第一步中，在谷胱甘 肽涂布的板上捕获GST标记的TNKS。然后在化合物不存在/存在下，用生物素化NAD进行 活性测定。在酶促反应期间，GST标记的TNKS将生物素化ADP-核糖由作为共同底物的生 物素化NAD转移至其自身。为了检测，加入结合于生物素化TNKS的链霉抗生物素-HRP缀 合物，由此被捕获到板上。生物素化resp自动聚ADP核糖化TNKS的量用HRP的发光底物 检测。发光信号的水平与自动聚ADP核糖化TNKS的量直接相关，由此也与TNKS活性直接 相关。
[0126] 活性ELISA在384孔谷胱甘肽涂布的微量滴定板（快速捕获谷胱甘肽涂布的板 (Express capture Glutathione coated plate), Biocat, Heidelberg, Germany)上进 行。用PBS预平衡各板。然后将板用50 μL 20 ng/孔GST-标记的Tnks-I (1023-1327 aa，内部制备），分别GST-标记的Tnks-2 (873-1166 aa，内部制备）在测定缓冲液（50 mM HEPES、4 mM氯化镁、0. 05 %普流罗尼克F-68、2 mM DTT，pH 7. 7)于4°C孵育过夜。用 PBS-Tween-20洗涤各板3次。通过于室温下用50 μL封闭缓冲液（PBS、0.05 % Tween-20、 0. 5 % BSA)孵育20分钟封闭各孔。此后用PBS-Tween-20洗涤各板3次。酶促反应在试 验化合物（10倍稀释浓度）不存在或存在下，在50 μL反应溶液（50 mM HEPES、4 mM氯 化镁、0.05 % 普流罗尼克 F-68、1.4 mM DTT、0.5 % DMSO, pH 7.7)中，用 10 μΜ bio-NAD (Biolog, Life science Inst·, Bremen, Germany)作为共同底物于 30°C 进行 1 小时。通过 用PBS-Tween-20洗涤3次终止反应。为了检测，加入在PBS/0. 05%Tween-20/0. 01%BSA中的 50 μL 20ng/Pl链霉抗生物素、HRP缀合物（MoBiTec, G5ttingen, Germany)并于室温下将 各板孵育30分钟。用PBS-Tween-20洗涤3次后，加入50 μL SuperSignal ELISA Femto最 大灵敏性（Maximum sensitivity)底物溶液（ThermoFisherScientific (Pierce), Bonn, Germany)。于室温下孵育1分钟后，用Envision多模阅读器（Perkin Elmer LAS Germany GmbH)于700 nm测量发光信号。所用的全值为无抑制剂的反应。所用的药理学零值为在5 剛的最终浓度中的XAV-939 (Tocris)。抑制值（IC50)使用程序Symyx Assay Explorer? 或者来自GeneData的Condosseo?测定。
[0127] 在上下文中，所有的温度以°(：表示。在以下实施例中，〃常规后处理（work-up) 〃 意指：必要时加入水，必要时调节pH值至2-10,这取决于终产物的组成，混合物用乙酸乙酯 或二氯甲烷萃取，分离各相，有机相经硫酸钠干燥并蒸发，残留物经硅胶色谱和/或结晶纯 化。硅胶上的Rf值；洗脱液：乙酸乙酯/甲醇9:1。
[0128] 1H NMR在Bruker 400 MHz分光计上记录，使用氖化溶剂的残留信号作为内标。化 学位移（δ)以相对于残留溶剂信号的ppm报告（对于在DMS0-d 6中的1H NMR，δ = 2.49 ppm)。1H NMR数据报告如下：化学位移（多重性，偶合常数和氢数）。多重性缩写如下：s (单峰），d (双峰），t (三重峰），q (四重峰），m (多重峰），br (宽峰）。
[0129] LCMS-分析： 方法 A:溶剂 A:水 + 0· 1 % TFA;溶剂 B: ACN + 0· 1 % TFA;流量：2 ml/min;梯 度：0 min: 5 % B, 8 min: 100 % B, 8. I min: 100 % B, 8. 5 min: 5% B, 10 min 5% B0 柱：XBridge C8, 3. 5 Mm, 4. 6 x 50 mm; 方法 B:溶剂 A: 10 mM NH4HCO3,溶剂 B: ACN;流速：I. 0 ml/min 柱：XBridge C8, 3· 5 Mm, 4· 6 x 50 mm; HPLC: 方法 A: Α-0· I % TFA/H20, Β-0· I % TFA/ACN:流量-2· 0 mL/min。 柱：XBridge C8 (50 χ 4· 6 mm, 3.5 μηι)〇 实施例
[0130] 苯基（哌啶-4-基）甲酮
将1-乙酰基哌啶-4-甲酸（3.0 g, 0.018 mol)按小份添加至亚硫酰氯（10 mL, 0. 143 mol)并在室温下搅拌4 h。在真空下浓缩该反应并用甲苯（2 X 200 mL)共蒸发。将 残余物溶解（微溶）在1，2-二氯乙烷中并添加至无水氯化铝在苯（20 mL)中的搅拌悬浮 液中。将所得混合物回流2 h，倾倒至碎冰中并用氯仿（2 X 200 mL)萃取。用盐水洗涤合 并的有机层，经无水Na2SO4干燥并蒸发以获得棕色胶。用6 N盐酸（60 mL)将获得的胶回 流6 h。将该反应冷却至室温并用乙醚（100 mL)洗涤。用10%氢氧化钠使水性部分呈碱 性并用乙醚（2 X 100 mL)萃取。用盐水洗涤合并的有机层，经无水Na2SO4干燥并蒸发至 干。通过柱层析法使用硅胶（60-120)和石油醚/乙酸乙酯作为梯度洗脱纯化残余物以提 供标题化合物；收率：1.5 g (45%) ;LCMS (方法B): 190.3 (M+H)，Rt: 2.01 min,纯度： 85. 3%;
[0131] 实施例1 4-苯甲酰基-哌啶-1-甲酸甲基-间甲苯基-酰胺（"Al")
向苯基（哌啶-4-基）甲酮（0.15 g，0.79 mmol)在DCM (10 mL)中的悬浮液中添 加二异丙基乙胺（0.30 g，2. 37 mmol)，然后在0 °C下逐滴添加三光气（0.23 g，0.79 mmol)。在搅拌30 min之后，将该反应冷却至0 °C并添加甲基-间甲苯基-胺（0.093 g, 0. 87 mmol)。在室温下搅拌该反应混合物16 h。用DCM (20 mL)稀释该反应混合物，用10% 碳酸氢钠（50 mL)、L 5 N HCl (50 mL)、水（50 mL)和盐水（50 mL)洗涤。经无水 Na2SfVf1 燥有机层并蒸发至干。通过柱层析法使用硅胶（60-120)和石油醚/乙酸乙酯作为梯度洗 脱纯化残余物以提供标题化合物；收率：58 mg (26%); LCMS (方法A): 337.2 (M+H)， Rt. 4. 93 min,纯度 99. 8% (254 nm); HPLC (方法 A): Rt. 4. 84 min,纯度 99. 8% (254 nm);
[0132] 实施例2 4-苯甲酰基-哌啶-1-甲酸甲基-对甲苯基-酰胺（〃A2〃）
类似于实施例1制备该化合物。 收率：79 mg (35%) ; LCMS (方法 A) : 337. 3 (M+H)，Rt. 5. 57 min,纯度：98. 2% (254 nm) ; HPLC (方法 A) : Rt. 4. 86 min,纯度 97. 8% (254 nm);
[0133] 实施例3 4-苯甲酰基-哌啶-1-甲酸（3-甲氧基-苯基）-甲基-酰胺（"A3")
类似于实施例1制备该化合物。 收率：56 mg (29 %); LCMS (方法A): 367.0 (M+H), Rt. 4.73 min,纯度96% (254 nm) ; HPLC (方法 A) : Rt. 4. 57 min,纯度 98. 5 % (254 nm);
[0134] 实施例4 4-苯甲酰基-哌啶-1-甲酸（4-甲氧基-苯基）-甲基-酰胺（〃A4〃）
类似于实施例1制备该化合物。 收率：28 mg (12%); LCMS (方法 A): 353.2 (M+H)，Rt. 4.47 min,纯度 98. 9% (254 nm) ; HPLC (方法 A) : Rt. 4. 45min, 99% (254 nm);
[0135] 实施例5 4-(4-甲基-苯甲酰基）-哌啶-1-甲酸（4-甲氧基-苯基）-甲基-酰胺（〃A5〃）
类似于实施例1制备该化合物。 收率：132 mg (29%); LCMS (方法 A): 367.3 (M+H), Rt. 4.80 min,纯度 99.9% (254 nm) ; HPLC (方法 A) : Rt. 4. 74 min, 99. 8% (254 nm);
[0136] 实施例6 4-(4-甲氧基-苯甲酰基）-哌啶-1-甲酸（4-甲氧基-苯基）-甲基-酰胺（〃八6〃）
类似于实施例1制备该化合物。 收率：8 mg (16%); LCMS (方法 A): 383.3 (M+H), Rt. 4.43 min,纯度 99. 7% (254 nm) ; HPLC (方法 A) : Rt. 4. 42 min, 99. 7% (254 nm);
[0137] 实施例7 4-(3-氟-苯甲酰基）-哌啶-1-甲酸（4-甲氧基-苯基）-甲基-酰胺（〃A7〃）
类似于实施例1制备该化合物。 收率：77 mg (17%); LCMS (方法A): 371.3 (M+H)，Rt. 4.59 min,纯度 98. 3% (254 nm) ; HPLC (方法 A) : Rt. 4. 76 min, 98. 2% (254 nm);
[0138] 实施例8 4-(4-氟-苯甲酰基）-哌啶-1-甲酸（4-甲氧基-苯基）-甲基-酰胺（〃A8〃）
类似于实施例1制备该化合物。 收率：8 mg (16%); LCMS (方法A): 371.2 (M+H), Rt. 4.63 min,纯度 99. 6% (254 nm) ; HPLC (方法 A) : Rt. 4. 60 min, 99. 8% (254 nm);
[0139] 实施例9 4-(4-氯-苯甲酰基）-哌啶-1-甲酸（4-甲氧基-苯基）-甲基-酰胺（〃A9〃）
类似于实施例1制备该化合物。 收率：183 mg (16%); LCMS (方法 A): 387.0 (M+H), Rt. 4.93 min,纯度 99. 5% (254 nm) ; HPLC (方法 A) : Rt. 4. 90 min, 99. 6% (254 nm);
[0140] 实施例10 4-苯甲酰基-哌啶-1-甲酸（3-氰基-苯基）-甲基-酰胺（〃A10〃）
类似于实施例1制备该化合物。 收率：4 mg (2%) ; LCMS (方法 A) : 405. 2 (M+H)，Rt. 4. 76 min,纯度 96. 8% (254 nm) ; HPLC (方法 A) : Rt. 4. 34 min, 94. 9% (254 nm);
[0141] 实施例11 4-苯甲酰基-哌啶-1-甲酸（4-氰基-苯基）-甲基-酰胺（"All")
类似于实施例1制备该化合物。 收率：12 mg (5%); LCMS (方法A): 348.0 (M+H)，Rt. 4.30 min,纯度 98.6% (254 nm) ; HPLC (方法 A) : Rt. 4. 46 min, 94. 9% (254 nm);
[0142] 实施例12 4-苯甲酰基-哌啶-1-甲酸（3-氟-苯基）-甲基-酰胺（"A12")
类似于实施例1制备该化合物。 收率：23 mg (10%); LCMS (方法 A): 341.3 (M+H)，RT. 4.68 min,纯度 99% (254 nm) ; HPLC (方法 B) : Rt. 6. 09 min, 94. 7% (254 nm);
[0143] 实施例13 4-苯甲酰基-哌啶-1-甲酸（4-氟-苯基）-甲基-酰胺（"A13")
类似于实施例1制备该化合物。 收率：26 mg (11%); LCMS (方法 A): 341.2 (M+H)，Rt. 4.70 min,纯度 98. 8% (254 nm); HPLC (方法 A): Rt. 4.61 min, 98.6% (254 nm);
[0144] 实施例14 4-苯甲酰基-哌啶-1-甲酸乙基-(4-甲氧基-苯基）-酰胺（〃A14〃）
类似于实施例1制备该化合物。 收率：103 mg (42%); LCMS (方法 A): 367.2 (M+H)，Rt. 4.82 min,纯度 100% (254 nm) ; HPLC (方法 A) : Rt. 4. 75 min, 100% (254 nm);
[0145] 实施例15 4-苯甲酰基-哌啶-1-甲酸（2-羟基-乙基）-(4-甲氧基-苯基）-酰胺（〃A15〃）
类似于实施例1制备该化合物，通过制备型HPLC纯化；收率：13 mg (17%); LCMS (方法 A) : 383. 2 (M+H)，Rt. 4. 07 min,纯度 98. 2% (254 nm) ; HPLC (方法八）：财· 4. 04 min, 98% (254 nm);
[0146] 实施例16 (4-苯甲酰基-哌啶-1-基）-(2, 3-二氢-吲哚-1-基）-甲酮（〃A16〃）
类似于实施例1制备该化合物。 收率：59 mg (26%); LCMS (方法 A): 335.2 (M+H), Rt. 4.78 min,纯度 98. 5% (254 nm) ; HPLC (方法 A) : Rt. 4. 74 min, 98. 5% (254 nm);
[0147] 实施例17 (2,3-二氢-吲哚-1-基）-[4-(4-甲基-苯甲酰基）-哌啶-1-基]-甲酮〇\17〃）
类似于实施例1制备该化合物。 收率：221 mg (52%); LCMS (方法 A): 349.2 (M+H), Rt. 5.11 min,纯度 98.6% (254 nm) ; HPLC (方法 A) : Rt. 5. 05 min, 97. 2% (254 nm);
[0148] 实施例18 (2, 3-二氢-吲哚-1-基）-[4- (4-甲氧基-苯甲酰基）-哌啶-1-基]-甲酮（〃A18〃）
类似于实施例1制备该化合物。 收率：8 mg (16%); LCMS (方法A): 365.0 (M+H)，Rt. 4.70 min,纯度 99. 9% (254 nm); HPLC (方法 A): Rt. 4.71 min, 99.7% (254 nm);
[0149] 实施例19 (2, 3-二氢-吲哚-1-基）-[4-(3-氟-苯甲酰基）-哌啶-1-基]-甲酮（〃A19〃）
类似于实施例1制备该化合物。 收率：60 mg (14%); LCMS (方法 A): 3